前言

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨實(shí)性惡性腫瘤之一，好發(fā)于青少年和年輕人?；颊叩臉?biāo)準(zhǔn)治療包括化療和手術(shù)。隨著各種先進(jìn)治療方法的發(fā)展，患者的存活率大大提高了。然而，目前還沒有已知的預(yù)防方法。因此，深入了解其發(fā)生機(jī)制，開發(fā)新的骨肉瘤治療藥物迫在眉睫。

N6-methyladenosine (m6A) 是真核生物mRNA中最豐富的可逆甲基化修飾。近年來，許多研究集中在m6a修飾的mRNA的生物學(xué)功能上。m6A修飾被發(fā)現(xiàn)參與多種生物學(xué)過程，并在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。如，F(xiàn)TO在急性髓系白血病(AML)中起著致癌因子的作用。ALKBH5已被證明與胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有關(guān)，并影響雄性小鼠的生育能力。然而，對(duì)于m6A修飾在人骨肉瘤中的功能和潛在機(jī)制仍有很大程度的未知。

研究結(jié)果

1. m6A去甲基化酶ALKBH5在人骨肉瘤中下調(diào)

作者首先采用m6A ELISA和免疫熒光(IF)法定量人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、Saos2、143B和人成骨細(xì)胞(hOB) hFOB1.19細(xì)胞系中m6A的含量。結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞中m6A含量顯著升高。此外，與hOB細(xì)胞相比，所有三種骨肉瘤細(xì)胞系中去甲基化酶ALKBH5 mRNA與m6A含量呈負(fù)相關(guān)顯著降低，但在METTL3、METTL14、WTAP和FTO中無此現(xiàn)象。同時(shí)，免疫染色證實(shí)，與hOB細(xì)胞相比，U2OS、Saos2、143B骨肉瘤細(xì)胞系中的ALKBH5顯著降低。此外，在人骨肉瘤組織中檢測(cè)到ALKBH5的蛋白表達(dá)低于正常骨組織。我們進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化(IHC)檢測(cè)含102個(gè)組織芯的骨肉瘤組織微陣列(TMAs)中ALKBH5蛋白的表達(dá)。與正常骨組織相比，在惡性骨肉瘤核心部位，特別是IVB期（最高程度的骨肉瘤）檢測(cè)到ALKBH5蛋白表達(dá)顯著降低。來自TCGA數(shù)據(jù)集的Kaplan-Meier生存分析顯示ALKBH5高表達(dá)的患者存活率較高，而低ALKBH5表達(dá)的患者存活率較低。以上結(jié)果表明，在人骨肉瘤中ALKBH5普遍下調(diào)，可能介導(dǎo)m6A修飾，在人骨肉瘤中發(fā)揮重要作用。

Fig.1在人骨肉瘤中m6A修飾水平上升伴隨著去甲基化酶ALKBH5表達(dá)的降低

2. ALKBH5-依賴的 m6A去甲基化嚴(yán)重影響骨肉瘤細(xì)胞的生長和運(yùn)動(dòng)

為了確定ALKBH5調(diào)控m6A修飾是否在骨肉瘤細(xì)胞中起作用，作者分別過表達(dá)、敲降A(chǔ)LKBH5的表達(dá)來驗(yàn)證其細(xì)胞功能。我們檢測(cè)了ALKBH5對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。與預(yù)期一致，過表達(dá)ALKBH5顯著抑制U2OS細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，而抑制ALKBH5的表達(dá)則誘導(dǎo)相反的作用。此外，當(dāng)ALKBH5過表達(dá)時(shí)，早期和晚期凋亡細(xì)胞百分比均顯著增加，而ALKBH5敲低對(duì)細(xì)胞的凋亡影響甚微。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)也產(chǎn)生類似的結(jié)果。

Fig.2 ALKBH5對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的抑瘤作用

3. 鑒定ALKBH5 / m6a - pre - miR - 181 - b - 1 / miR -181b-5p-YAP軸作為一種新的通路抑制骨肉瘤腫瘤的進(jìn)展

（1）ALKBH5通過調(diào)控pre-miR-181b-1的表達(dá)水平抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖

如上所示，作者已經(jīng)證明了ALKBH5依賴的m6A rna去甲基化對(duì)骨肉瘤腫瘤抑制的重要性。接下來，進(jìn)一步深入了解其具體的分子機(jī)制。MiRNA的加工過程也受到骨肉瘤的特異性調(diào)控。然而，尚無報(bào)道顯示m6A修飾在骨肉瘤miRNA加工過程中的生物學(xué)功能。因此，作者使用m6A 芯片在對(duì)照和過表達(dá)ALKBH5的U2OS細(xì)胞中鑒定ALKBH5修飾的miRNAs前體。通過微陣列檢測(cè)到773個(gè)pre- miRNA，鑒定出11個(gè)在ALKBH5過表達(dá)的細(xì)胞中，比對(duì)照細(xì)胞減少20%(>減少1.2倍)的pre- miRNA。值得注意的是，在pre- mirna中，pre-miR-181b-1再過表達(dá)ALKBH5后，甲基化顯著降低。更重要的是，pre-miR-181b-1序列在不同物種間廣泛保守。這些發(fā)現(xiàn)表明在骨肉瘤中pre-miR-181b-1是ALKBH5的一個(gè)潛在的作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，premiR-181b-1在m6A-RIP中富集，而在IgG-IP中不富集。此外，pre-miR-181b-1和成熟miR-181b-5p在骨肉瘤細(xì)胞中明顯低于hOB細(xì)胞。過表達(dá)ALKBH5可顯著增加U2OS細(xì)胞中premiR-181b-1和miR-181b-5p的表達(dá)水平。相反，抑制ALKBH5產(chǎn)生相反的效果。正如作者所猜想，miR-181b-5p導(dǎo)致細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖的減少。miR-181b-5p下調(diào)(AMO-181b-5p)部分挽救了U2OS細(xì)胞中ALKBH5過表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞遷移和增殖下降。

Fig.3 ALKBH5削弱pre-miR-181b-1的mA6甲基化修飾水平并提高pre-miR-181b-1和miR-181-5p的表達(dá)水平

（2）YAP是人骨肉瘤細(xì)胞中miR-181-5p的關(guān)鍵靶基因

然后通過計(jì)算預(yù)測(cè)尋找miR-181-5p候選靶基因。通過這種方式，作者發(fā)現(xiàn)Yesassociated protein 1 (YAP)是miR-181-5p潛在的靶基因。有報(bào)道稱YAP是一種致癌基因，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。接下來，作者證實(shí)了過表達(dá)的miR-181b-5p確實(shí)直接抑制了其靶基因YAP在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ALKBH5明顯抑制了U2OS細(xì)胞中YAP的mRNA和蛋白水平，而抑制ALKBH5則使YAP的表達(dá)升高。同時(shí)，作者證實(shí)了YAP對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長的影響。siRNA沉默YAP顯著抑制了U2OS細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和集落形成能力。

Fig. 4 YAP是人骨肉瘤細(xì)胞中miR-181-5p的關(guān)鍵靶基因

（3）YAP消除了ALKBH5對(duì)骨肉瘤細(xì)胞活力和小鼠異種腫瘤生長的抑制作用

為探究ALKBH5與YAP的相互關(guān)系，作者進(jìn)一步分析了細(xì)胞生長的影響。與單獨(dú)過表達(dá)ALKBH5相比，ALKBH5與YAP共表達(dá)組的細(xì)胞增殖明顯增加。YAP還抵消了ALKBH5對(duì)U2OS細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用，YAP顯著提高了活細(xì)胞百分率，減少了凋亡細(xì)胞，恢復(fù)了集落形成能力。并且，作者利用異種骨肉瘤小鼠模型評(píng)估了ALKBH5介導(dǎo)的m6A去甲基化的體內(nèi)有效性。腫瘤體積和重量的降低，證明了ALKBH5過表達(dá)降低了骨肉瘤腫瘤的生長，而這一效果通過共轉(zhuǎn)染過表達(dá)的YAP而抵消。

4）m6A讀取蛋白YTHDF2正調(diào)節(jié)pre-miR-181b-1的穩(wěn)定

因?yàn)锳LKBH5介導(dǎo)的m6A去甲基化似乎增加了pre-miR-181b-1的表達(dá)，猜想pre-miR-181b-1是YTHDF2（促進(jìn)m6A甲基化RNA降解的m6A讀取蛋白）的一個(gè)靶點(diǎn)，與作者的猜想一致，再YTHDF2-IP組分中觀察到pre-miR-181b-1的強(qiáng)烈富集。進(jìn)一步，在U2OS細(xì)胞使用siYTHDF2敲降其表達(dá)后，pre-miR-181b-1和miR-181b-5p的表達(dá)均增加。此外，siYTHDF2可進(jìn)一步增強(qiáng)ALKBH5過表達(dá)的抑瘤作用。以上數(shù)據(jù)表明ALKBH5介導(dǎo)的pre-miR-181b-1 m6A去甲基化在骨肉瘤中起關(guān)鍵作用。

Fig. 6 m6A讀取蛋白YTHDF2正調(diào)節(jié)pre-miR-181b-1的穩(wěn)定

4. 鑒定YAP mRNA作為ALKBH5在骨肉瘤中的直接靶點(diǎn)

（1）ALKBH5直接調(diào)控YAP的mRNA和蛋白穩(wěn)定性

有趣的是，根據(jù)基于序列的m6A修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://www.cuilab.cn/ SRAMP)，作者觀察到Y(jié)AP基因的mRNA攜帶9個(gè)潛在的m6A修飾位點(diǎn)。接下來作者驗(yàn)證了ALKBH5是否可以直接調(diào)控YAP的m6A甲基化和基因降解。采用基因特異性m6A-qPCR檢測(cè)YAP的表達(dá)。過表達(dá)ALKBH5后，m6A- RIP組YAP mRNA中m6A豐度明顯降低，IgG-RIP組未見明顯變化。此外，與siNC組相比，siALKBH5在轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin D (ActD)存在的情況下增強(qiáng)了U2OS細(xì)胞中YAP mRNA的穩(wěn)定性。同時(shí)，siALKBH5在翻譯抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHX)的作用下抑制了YAP的降解。然而，過表達(dá)ALKBH5產(chǎn)生相反的作用，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞中YAP-mRNA穩(wěn)定性顯著下降，YAP蛋白降解增加。

Fig. 7 ALKBH5直接調(diào)控YAP的mRNA和蛋白穩(wěn)定性

（2）m6A-依賴的YAP的翻譯增強(qiáng)與YTHDF1呈正相關(guān)

以上結(jié)果表明，ALKBH5介導(dǎo)的m6A去甲基化抑制了YAP的表達(dá)，我們推測(cè)甲基化的YAP轉(zhuǎn)錄本是YTHDF1（促進(jìn)甲基化轉(zhuǎn)錄本翻譯的m6A讀取蛋白）的潛在靶點(diǎn)。與IgG-RIP組相比，YTHDF1組YAP mRNA中的豐度明顯增加，說明YTHDF1能夠識(shí)別YAP mRNA中的m6修飾位點(diǎn)。接下來，作者發(fā)現(xiàn)YTHDF1 siRNA (siYTHDF1)降低了YAP蛋白水平。且在ALKBH5過表達(dá)的U2OS細(xì)胞中，過表達(dá)YTHDF1導(dǎo)致YAP增加。此外，與預(yù)期一致，上調(diào)YTHDF1水平可部分恢復(fù)對(duì)U2OS細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡和集落形成能力的抑制作用。

Fig. 8 m6A-依賴的YAP的翻譯增強(qiáng)與YTHDF1呈正相關(guān)

總結(jié)

總的來說，作者的結(jié)果首次表明ALKBH5是一種抗腫瘤或促凋亡因子，至少部分地通過直接m6A甲基化YAP及甲基化pre-miR-181b-1間接下調(diào)YAP水平的雙機(jī)制抑制YAP的表達(dá)來發(fā)揮作用。同時(shí)，作者也證明了pre-miRNAs可以被ALKBH5甲基化調(diào)控其成熟加工的過程。