一、導(dǎo)言

今天小編分享一篇2020年11月25日發(fā)表于Cell的文章——Direct Tumor Killing and Immunotherapy through Anti-SerpinB9 Therapy（IF：38.637）癌癥療法通過引發(fā)免疫反應(yīng)直接或間接殺死腫瘤，并已獲得不同程度的臨床應(yīng)用。在這里，作者提供了一種基于直接殺傷腫瘤和觸發(fā)保護(hù)性免疫來控制腫瘤生長的新療法。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白SerpinB9（Sb9）的基因消融導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞以顆粒酶B（GrB）依賴性方式死亡。缺乏Sb9的小鼠對(duì)腫瘤表現(xiàn)出基于宿主免疫力T細(xì)胞的保護(hù)作用，并與腫瘤微環(huán)境（TME）中表達(dá)GrB的免疫抑制細(xì)胞減少有關(guān)。當(dāng)腫瘤和宿主缺乏Sb9時(shí)，觀察到針對(duì)腫瘤發(fā)展的最大保護(hù)。Sb9抑制的治療作用通過控制腫瘤生長并延長小鼠存活時(shí)間得到證明。總之，研究者發(fā)現(xiàn)了一種分子靶標(biāo)，該靶標(biāo)可將腫瘤消融、TME干擾和免疫療法以一種潛在的方式結(jié)合在一起，這也是該文章極具創(chuàng)新的核心思路。

二、結(jié)論

? SerpinB9保護(hù)癌細(xì)胞免受自身顆粒酶B的侵害；

? CAFs、MDSCs和TAMs中SerpinB9的表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長；

? 腫瘤和宿主中SerpinB9的缺失明顯抑制腫瘤的生長；

? SerpinB9抑制可同時(shí)靶向癌細(xì)胞、CAFs、MDSCs和TAMs。

三、結(jié)果展示

# Sb9保護(hù)黑色素瘤免受GrB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 #

研究者檢查了Sb9和GrB在原發(fā)性人類和小鼠惡性黑色素瘤（B16），乳腺腺癌（4T1）和肺腺癌（LLC1）中的表達(dá)情況（圖1A、圖1B）。在B16細(xì)胞中，Sb9通過經(jīng)典的serpin機(jī)制抑制GrB，產(chǎn)生抗SDS的62 kDa Sb9-GrB復(fù)合物。WB結(jié)果表明，Sb9主要表達(dá)為47 kDa的未結(jié)合單體，而一小部分形成62 kDa Sb9-GrB復(fù)合物（圖1C）；幾乎所有的GrB都與Sb9形成62 kDa Sb9-GrB復(fù)合物（圖1D）。RNAscope染色證明B16和4T1細(xì)胞中GrB（綠色）的基因表達(dá)（圖1E）。此外，GranToxiLux分析表明，B16中的GrB具有功能活性（圖1F）。為了確定Sb9對(duì)GrB的保護(hù)作用，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除（KO）B16細(xì)胞中的SERPINB9基因。WB驗(yàn)證復(fù)合物形成受阻，表明細(xì)胞中的所有GrB不再被Sb9捕獲；RNAscope和IF染色也證實(shí)其在B16-Sb9 KO細(xì)胞中缺乏表達(dá)。與B16-WT細(xì)胞相比，B16-Sb9 KO細(xì)胞的GrB特異性凋亡增加2.3倍（圖1H）。此外發(fā)現(xiàn)，在IL-2處理的B16-WT細(xì)胞中，GrB mRNA表達(dá)水平更高（圖1G），細(xì)胞中裂解的caspase-3表達(dá)更低。用不同濃度的IL-2處理后，B16-WT和B16-Sb9 KO細(xì)胞的凋亡率均顯著更高（圖1H）。用IL-2治療后，應(yīng)用GrB抑制劑368050可抑制細(xì)胞凋亡。總的來說，這些結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞需要Sb9來保護(hù)其免受GrB誘導(dǎo)的凋亡。

# Sb9的細(xì)胞內(nèi)在作用調(diào)控腫瘤生長 #

將B16-WT或B16-Sb9 KO細(xì)胞皮下注射到C57BL/6小鼠中監(jiān)測腫瘤生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植入后第27天Sb9破壞的腫瘤比B16-WT組小4倍（圖2A）。此外還發(fā)現(xiàn)B16-Sb9＆GrB KO腫瘤的生長快于 B16-Sb9 KO腫瘤，但慢于B16-WT腫瘤。植入后第17天用黑色素瘤標(biāo)記物MelanA進(jìn)行染色，結(jié)果顯示B16-Sb9 KO組的MelanA＋面積比B16-WT組小得多（圖2B、圖2C）。攜帶B16-Sb9 KO腫瘤的小鼠的中位生存時(shí)間（MST）比攜帶B16-WT腫瘤的小鼠的明顯更長。與體內(nèi)的B16-WT腫瘤相比，B16-Sb9 KO腫瘤表現(xiàn)出更多的凋亡情況（圖2D-2F）；而Tregs、TAMs（M1和M2）和MDSCs水平?jīng)]有差異（圖2G-2I），表明Sb9腫瘤的表達(dá)對(duì)腫瘤微環(huán)境（TME）中免疫抑制細(xì)胞群的比例影響最小。此外，B16-Sb9 KO腫瘤的轉(zhuǎn)移也減少了，如腫瘤引流淋巴結(jié)（TDLNs）中黑色素瘤細(xì)胞水平的降低（圖2J-2L）；TDLN的大小也顯著小于B16-WT組（圖2K-2M）。在人黑素瘤轉(zhuǎn)移灶中，可觀察到Sb9和MelanA 的共表達(dá)（圖2N）。C57BL/6小鼠皮下注射過表達(dá)Sb9的B16細(xì)胞后，觀察到腫瘤的生長明顯更快（圖2P）。結(jié)果表明，Sb9的表達(dá)以細(xì)胞內(nèi)在的方式促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

# Sb9缺失可恢復(fù)宿主腫瘤免疫并破壞TME基質(zhì) #

接下來研究Sb9在宿主對(duì)Sb9 KO小鼠的腫瘤免疫應(yīng)答中的作用。與WT小鼠相比，Sb9 KO小鼠的黑素瘤瘤生長更慢，MST明顯更長（圖3A-3B）。但是，當(dāng)腫瘤和宿主均缺乏Sb9時(shí)，觀察到針對(duì)黑素瘤發(fā)展的最大保護(hù)作用（圖3C、3D）。植入Sb9 KO腫瘤的Sb9 KO小鼠（Sb9 KO/Sb9 KO組）的MST比植入WT腫瘤的WT小鼠（WT/WT組）的長得多。與WT/WT組相比，Sb9 KO/Sb9 KO組腫瘤引起的Sb9缺乏導(dǎo)致caspase-3和GrB表達(dá)增加。Tregs是抗腫瘤效應(yīng)T細(xì)胞的有效抑制細(xì)胞，由內(nèi)源性Sb9保護(hù)其免受細(xì)胞內(nèi)GrB的影響。與WT/WT組相比，Sb9 KO/Sb9 KO組的CD8＋/Treg、CD44＋CD62L－CD8＋/Treg細(xì)胞、TNFa＋CD8＋/Treg、GrB＋CD8＋/Treg的比值均顯著高于WT/WT組（圖3E-3H）。除Treg外，免疫抑制性TAM和MDSC的募集在腫瘤進(jìn)展中也起著至關(guān)重要的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sb9在黑色素瘤和乳腺瘤的TAM和MDSC內(nèi)表達(dá)。與WT/WT組相比，Sb9 KO/Sb9 KO組的黑色素瘤切片中，TAMs和MDSCs的水平顯著降低（圖3I、圖3J）。因此可得出結(jié)論：在Tregs、TAMs和MDSCs中，Sb9的缺失使它們暴露于TME內(nèi)GrB介導(dǎo)的殺傷，最終導(dǎo)致抗腫瘤免疫應(yīng)答的恢復(fù)和腫瘤發(fā)展的抑制。此外，在Sb9 KO/Sb9 KO組的TME切片中發(fā)現(xiàn)效應(yīng)性IL-2＋CD4＋細(xì)胞水平升高，免疫抑制性IL-10＋CD4＋細(xì)胞和IL-10＋CD8＋細(xì)胞水平降低（圖3K，圖3L）。Sb9 KO/Sb9 KO組黑色素瘤中成纖維細(xì)胞（CAF）的數(shù)量，如FN、Collagen-I、PDGFR-β、α-SMA的表達(dá)顯著降低（圖3M-3P）。為了進(jìn)一步評(píng)估腫瘤基質(zhì)中Sb9表達(dá)對(duì)腫瘤生長的影響，將B16-GFP細(xì)胞與從C57BL/6-WT或Sb9 KO小鼠的骨髓中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）共培養(yǎng)。共培養(yǎng)的MSC-WT和B16-GFP細(xì)胞的顯微照片顯示，MSC-WT和B16細(xì)胞組成多個(gè)密集簇，而MSC-Sb9 KO和B16細(xì)胞則分散且彼此不靠近（圖3Q）。然后，評(píng)估了FN和Collagen-I的積聚（纖維化TME的替代標(biāo)志物，可阻礙化療藥物滲透）。結(jié)果觀察到，與B16-GFP細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，MSC-WT比MSC-Sb9 KO細(xì)胞更容易產(chǎn)生FN和Collagen-I（圖3Q-3S）。這些數(shù)據(jù)表明，Sb9在基質(zhì)細(xì)胞中的存在促進(jìn)了它們的生長、ECM纖維的合成以及對(duì)B16細(xì)胞的增殖作用。

# Sb9小分子抑制劑激活腫瘤保護(hù)性免疫 #

運(yùn)用一種基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)方法來鑒定一種小的有機(jī)分子，該分子可與大腸桿菌產(chǎn)生的重組人Sb9結(jié)合。為表達(dá)可溶性Sb9，構(gòu)建麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）N端融合蛋白，并用SDS-PAGE和MALDI-TOF對(duì)其進(jìn)行鑒定。MBP-Sb9的功能活性通過其對(duì)分離的GrB活性的劑量依賴性抑制效應(yīng)來測量。研究者開發(fā)了一種熱穩(wěn)定性分析方法（TSA），顯示在51.5℃（Tm1）下的Sb9特異性轉(zhuǎn)變，并根據(jù)劑量依賴性的Tm1偏移（圖4A）用于篩選識(shí)別出兩種化合物（ZT0587和ZT0805），片段ZT0587與MBP-Sb9結(jié)合，KD為88 μM（圖4B）。其中一個(gè)化合物3034（1,3-苯并惡唑-6-羧酸），通過SPR測量顯示出與Sb9直接結(jié)合的KD為273 μM（圖4B）。接下來，通過測量caspase-3活性（GrB活性增加的替代標(biāo)記物）的誘導(dǎo)，評(píng)估B16細(xì)胞中最高等級(jí)類似物抑制細(xì)胞內(nèi)Sb9和細(xì)胞穿透的能力。與ZT0587相比，3034處理的caspase-3活性增加4倍（圖4C）。此外，用3034處理的B16細(xì)胞在12 h和24 h的凋亡率均顯著高于ZT0587。STD-NMR分析表明化合物3034與MBP-Sb9結(jié)合，并且以低pH依賴的方式顯著增強(qiáng)（圖4D、圖4E）。當(dāng)pH值低至4時(shí)，溶酶體是細(xì)胞內(nèi)酸性最強(qiáng)的部分。因此假設(shè)溶酶體的環(huán)境有利于化合物3034與Sb9的結(jié)合。結(jié)果顯示，Sb9和GrB共定位于B16細(xì)胞的溶酶體中（圖4F），并且化合物3034通過B16細(xì)胞以濃度依賴性方式降低Sb9-GrB的表達(dá)（圖4G）。有趣的是，化合物3034顯著增加LAMP1的表達(dá)和溶酶體擴(kuò)張，表明Sb9與溶酶體生物活性有關(guān)（圖4H）。

# Sb9小分子抑制劑治療抑制體內(nèi)黑色素瘤生長 #

與對(duì)照組相比，化合物3034的注射顯著減少植入小鼠側(cè)面的B16腫瘤的大小（圖5A）。與對(duì)照組相比，3034治療組的黑色素瘤切片中CD44＋CD62L－CD8＋細(xì)胞、GrB＋CD8＋細(xì)胞和IFNγ＋CD8＋細(xì)胞的數(shù)量均顯著高于對(duì)照組（圖5B-5D）。與對(duì)照組相比，3034治療組的切片中免疫抑制性Treg、TAM 和MDSC的水平顯著降低（圖5E-5G）。此外，在3034治療組的TME切片中發(fā)現(xiàn)IFNγ＋CD4＋細(xì)胞水平升高，IL-10＋CD4＋細(xì)胞和IL-10＋CD8＋細(xì)胞水平降低（圖5H）。為了評(píng)估化合物3034的抗腫瘤作用是否可應(yīng)用于人類疾病，研究者測試了NSG人源化A375小鼠模型的療效。與對(duì)照組相比，化合物3034顯著減少人黑色素瘤的大小。化合物3034在B16黑色素瘤中誘導(dǎo)GrB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖5I）。GranToxiLux分析證明了在用化合物3034處理的B16細(xì)胞中GrB的活性增加（圖5J、圖5K）。因此可得出結(jié)論：化合物3034可抑制黑色素瘤細(xì)胞中的Sb9，并使其易受GrB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。接下來用不同濃度的化合物3034處理B16-Sb9 KO細(xì)胞，評(píng)估其對(duì)Sb9的脫靶作用，結(jié)果未觀察到其他凋亡作用（圖5L）。此外，與對(duì)照組相比，未觀察到化合物3034對(duì)帶有B16-Sb9 KO腫瘤的Sb9 KO小鼠的抗腫瘤作用（圖5M）。為了進(jìn)一步評(píng)估其體內(nèi)毒性，將300 mg化合物3034每天兩次腹腔內(nèi)給藥14天。CBC結(jié)果顯示對(duì)照組和治療組之間的WBC、HGB和PLT沒有顯著差異。血清細(xì)胞表明兩組之間的AST、ALT、CRE和ALB水平相似。HE染色顯示化合物3034對(duì)小鼠的肝、腎、肺和心臟組織沒有毒性。

# Sb9抑制劑治療抑制體內(nèi)乳腺瘤生長 #

為了研究化合物3034對(duì)腫瘤基質(zhì)的作用，將MSC-WT細(xì)胞用化合物3034處理48 h。化合物3034顯著降低MSC-WT細(xì)胞產(chǎn)生的FN和Collagen-I（圖6A），并且顯著降低與B16細(xì)胞共培養(yǎng)的MSC-WT細(xì)胞產(chǎn)生的FN和Collagen-I（圖6B、圖6C）。乳腺癌的周圍基質(zhì)具有高度的免疫抑制作用。Sb9在人類原發(fā)性乳腺瘤細(xì)胞和TM內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)。因此，研究了化合物3034是否可用于治療植入4T1乳腺瘤的小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，化合物3034治療顯著降低4T1衍生瘤的大小。用化合物3034治療4T1腫瘤的MST顯著長于對(duì)照組。化合物3034的處理還導(dǎo)致基質(zhì)細(xì)胞和CAF的水平降低（圖6E-6J）。此外，在另外兩個(gè)體內(nèi)腫瘤模型（Renca腎瘤和LLC1肺瘤）中觀察到了化合物3034類似的抗腫瘤作用（圖6K、圖6L）。最后得出結(jié)論：化合物3034對(duì)Sb9的抑制作用在包括黑色素瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤（乳腺癌、肺癌和腎癌）中具有抗腫瘤作用。

總結(jié)全文，實(shí)驗(yàn)研究表明Sb9的基因消融不僅通過CL衍生的GrB，而且通過內(nèi)源性產(chǎn)生的GrB使腫瘤對(duì)殺傷更加敏感，共同導(dǎo)致了對(duì)小鼠癌癥的控制。在Sb9-KO小鼠體內(nèi)研究了Sb9在抗腫瘤宿主反應(yīng)中的作用，發(fā)現(xiàn)該小鼠對(duì)腫瘤的抵抗力增強(qiáng)。這些是TME中免疫抑制TAMs、MDSCs、Tregs和CAFs的存活受損導(dǎo)致抗腫瘤CL活性增加的結(jié)果。最后研究者開發(fā)了一種Sb9特異性小分子抑制劑3034，并且顯示小鼠通過對(duì)GrB的直接致敏和保護(hù)性免疫的激活來控制腫瘤的生長。