一、導(dǎo)言
今天小編分享一篇2020年11月25日發(fā)表于Cell的文章——Direct Tumor Killing and Immunotherapy through Anti-SerpinB9 Therapy(IF:38.637)癌癥療法通過引發(fā)免疫反應(yīng)直接或間接殺死腫瘤,并已獲得不同程度的臨床應(yīng)用。在這里,作者提供了一種基于直接殺傷腫瘤和觸發(fā)保護(hù)性免疫來控制腫瘤生長的新療法。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白SerpinB9(Sb9)的基因消融導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞以顆粒酶B(GrB)依賴性方式死亡。缺乏Sb9的小鼠對(duì)腫瘤表現(xiàn)出基于宿主免疫力T細(xì)胞的保護(hù)作用,并與腫瘤微環(huán)境(TME)中表達(dá)GrB的免疫抑制細(xì)胞減少有關(guān)。當(dāng)腫瘤和宿主缺乏Sb9時(shí),觀察到針對(duì)腫瘤發(fā)展的最大保護(hù)。Sb9抑制的治療作用通過控制腫瘤生長并延長小鼠存活時(shí)間得到證明。總之,研究者發(fā)現(xiàn)了一種分子靶標(biāo),該靶標(biāo)可將腫瘤消融、TME干擾和免疫療法以一種潛在的方式結(jié)合在一起,這也是該文章極具創(chuàng)新的核心思路。
二、結(jié)論
? SerpinB9保護(hù)癌細(xì)胞免受自身顆粒酶B的侵害;
? CAFs、MDSCs和TAMs中SerpinB9的表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長;
? 腫瘤和宿主中SerpinB9的缺失明顯抑制腫瘤的生長;
? SerpinB9抑制可同時(shí)靶向癌細(xì)胞、CAFs、MDSCs和TAMs。
三、結(jié)果展示
# Sb9保護(hù)黑色素瘤免受GrB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 #
研究者檢查了Sb9和GrB在原發(fā)性人類和小鼠惡性黑色素瘤(B16),乳腺腺癌(4T1)和肺腺癌(LLC1)中的表達(dá)情況(圖1A、圖1B)。在B16細(xì)胞中,Sb9通過經(jīng)典的serpin機(jī)制抑制GrB,產(chǎn)生抗SDS的62 kDa Sb9-GrB復(fù)合物。WB結(jié)果表明,Sb9主要表達(dá)為47 kDa的未結(jié)合單體,而一小部分形成62 kDa Sb9-GrB復(fù)合物(圖1C);幾乎所有的GrB都與Sb9形成62 kDa Sb9-GrB復(fù)合物(圖1D)。RNAscope染色證明B16和4T1細(xì)胞中GrB(綠色)的基因表達(dá)(圖1E)。此外,GranToxiLux分析表明,B16中的GrB具有功能活性(圖1F)。為了確定Sb9對(duì)GrB的保護(hù)作用,應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除(KO)B16細(xì)胞中的SERPINB9基因。WB驗(yàn)證復(fù)合物形成受阻,表明細(xì)胞中的所有GrB不再被Sb9捕獲;RNAscope和IF染色也證實(shí)其在B16-Sb9 KO細(xì)胞中缺乏表達(dá)。與B16-WT細(xì)胞相比,B16-Sb9 KO細(xì)胞的GrB特異性凋亡增加2.3倍(圖1H)。此外發(fā)現(xiàn),在IL-2處理的B16-WT細(xì)胞中,GrB mRNA表達(dá)水平更高(圖1G),細(xì)胞中裂解的caspase-3表達(dá)更低。用不同濃度的IL-2處理后,B16-WT和B16-Sb9 KO細(xì)胞的凋亡率均顯著更高(圖1H)。用IL-2治療后,應(yīng)用GrB抑制劑368050可抑制細(xì)胞凋亡。總的來說,這些結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞需要Sb9來保護(hù)其免受GrB誘導(dǎo)的凋亡。
# Sb9的細(xì)胞內(nèi)在作用調(diào)控腫瘤生長 #
將B16-WT或B16-Sb9 KO細(xì)胞皮下注射到C57BL/6小鼠中監(jiān)測腫瘤生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn),植入后第27天Sb9破壞的腫瘤比B16-WT組小4倍(圖2A)。此外還發(fā)現(xiàn)B16-Sb9&GrB KO腫瘤的生長快于 B16-Sb9 KO腫瘤,但慢于B16-WT腫瘤。植入后第17天用黑色素瘤標(biāo)記物MelanA進(jìn)行染色,結(jié)果顯示B16-Sb9 KO組的MelanA+面積比B16-WT組小得多(圖2B、圖2C)。攜帶B16-Sb9 KO腫瘤的小鼠的中位生存時(shí)間(MST)比攜帶B16-WT腫瘤的小鼠的明顯更長。與體內(nèi)的B16-WT腫瘤相比,B16-Sb9 KO腫瘤表現(xiàn)出更多的凋亡情況(圖2D-2F);而Tregs、TAMs(M1和M2)和MDSCs水平?jīng)]有差異(圖2G-2I),表明Sb9腫瘤的表達(dá)對(duì)腫瘤微環(huán)境(TME)中免疫抑制細(xì)胞群的比例影響最小。此外,B16-Sb9 KO腫瘤的轉(zhuǎn)移也減少了,如腫瘤引流淋巴結(jié)(TDLNs)中黑色素瘤細(xì)胞水平的降低(圖2J-2L);TDLN的大小也顯著小于B16-WT組(圖2K-2M)。在人黑素瘤轉(zhuǎn)移灶中,可觀察到Sb9和MelanA 的共表達(dá)(圖2N)。C57BL/6小鼠皮下注射過表達(dá)Sb9的B16細(xì)胞后,觀察到腫瘤的生長明顯更快(圖2P)。結(jié)果表明,Sb9的表達(dá)以細(xì)胞內(nèi)在的方式促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
# Sb9缺失可恢復(fù)宿主腫瘤免疫并破壞TME基質(zhì) #
接下來研究Sb9在宿主對(duì)Sb9 KO小鼠的腫瘤免疫應(yīng)答中的作用。與WT小鼠相比,Sb9 KO小鼠的黑素瘤瘤生長更慢,MST明顯更長(圖3A-3B)。但是,當(dāng)腫瘤和宿主均缺乏Sb9時(shí),觀察到針對(duì)黑素瘤發(fā)展的最大保護(hù)作用(圖3C、3D)。植入Sb9 KO腫瘤的Sb9 KO小鼠(Sb9 KO/Sb9 KO組)的MST比植入WT腫瘤的WT小鼠(WT/WT組)的長得多。與WT/WT組相比,Sb9 KO/Sb9 KO組腫瘤引起的Sb9缺乏導(dǎo)致caspase-3和GrB表達(dá)增加。Tregs是抗腫瘤效應(yīng)T細(xì)胞的有效抑制細(xì)胞,由內(nèi)源性Sb9保護(hù)其免受細(xì)胞內(nèi)GrB的影響。與WT/WT組相比,Sb9 KO/Sb9 KO組的CD8+/Treg、CD44+CD62L-CD8+/Treg細(xì)胞、TNFa+CD8+/Treg、GrB+CD8+/Treg的比值均顯著高于WT/WT組(圖3E-3H)。除Treg外,免疫抑制性TAM和MDSC的募集在腫瘤進(jìn)展中也起著至關(guān)重要的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Sb9在黑色素瘤和乳腺瘤的TAM和MDSC內(nèi)表達(dá)。與WT/WT組相比,Sb9 KO/Sb9 KO組的黑色素瘤切片中,TAMs和MDSCs的水平顯著降低(圖3I、圖3J)。因此可得出結(jié)論:在Tregs、TAMs和MDSCs中,Sb9的缺失使它們暴露于TME內(nèi)GrB介導(dǎo)的殺傷,最終導(dǎo)致抗腫瘤免疫應(yīng)答的恢復(fù)和腫瘤發(fā)展的抑制。此外,在Sb9 KO/Sb9 KO組的TME切片中發(fā)現(xiàn)效應(yīng)性IL-2+CD4+細(xì)胞水平升高,免疫抑制性IL-10+CD4+細(xì)胞和IL-10+CD8+細(xì)胞水平降低(圖3K,圖3L)。Sb9 KO/Sb9 KO組黑色素瘤中成纖維細(xì)胞(CAF)的數(shù)量,如FN、Collagen-I、PDGFR-β、α-SMA的表達(dá)顯著降低(圖3M-3P)。為了進(jìn)一步評(píng)估腫瘤基質(zhì)中Sb9表達(dá)對(duì)腫瘤生長的影響,將B16-GFP細(xì)胞與從C57BL/6-WT或Sb9 KO小鼠的骨髓中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)共培養(yǎng)。共培養(yǎng)的MSC-WT和B16-GFP細(xì)胞的顯微照片顯示,MSC-WT和B16細(xì)胞組成多個(gè)密集簇,而MSC-Sb9 KO和B16細(xì)胞則分散且彼此不靠近(圖3Q)。然后,評(píng)估了FN和Collagen-I的積聚(纖維化TME的替代標(biāo)志物,可阻礙化療藥物滲透)。結(jié)果觀察到,與B16-GFP細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),MSC-WT比MSC-Sb9 KO細(xì)胞更容易產(chǎn)生FN和Collagen-I(圖3Q-3S)。這些數(shù)據(jù)表明,Sb9在基質(zhì)細(xì)胞中的存在促進(jìn)了它們的生長、ECM纖維的合成以及對(duì)B16細(xì)胞的增殖作用。
# Sb9小分子抑制劑激活腫瘤保護(hù)性免疫 #
運(yùn)用一種基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)方法來鑒定一種小的有機(jī)分子,該分子可與大腸桿菌產(chǎn)生的重組人Sb9結(jié)合。為表達(dá)可溶性Sb9,構(gòu)建麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)N端融合蛋白,并用SDS-PAGE和MALDI-TOF對(duì)其進(jìn)行鑒定。MBP-Sb9的功能活性通過其對(duì)分離的GrB活性的劑量依賴性抑制效應(yīng)來測量。研究者開發(fā)了一種熱穩(wěn)定性分析方法(TSA),顯示在51.5℃(Tm1)下的Sb9特異性轉(zhuǎn)變,并根據(jù)劑量依賴性的Tm1偏移(圖4A)用于篩選識(shí)別出兩種化合物(ZT0587和ZT0805),片段ZT0587與MBP-Sb9結(jié)合,KD為88 μM(圖4B)。其中一個(gè)化合物3034(1,3-苯并惡唑-6-羧酸),通過SPR測量顯示出與Sb9直接結(jié)合的KD為273 μM(圖4B)。接下來,通過測量caspase-3活性(GrB活性增加的替代標(biāo)記物)的誘導(dǎo),評(píng)估B16細(xì)胞中最高等級(jí)類似物抑制細(xì)胞內(nèi)Sb9和細(xì)胞穿透的能力。與ZT0587相比,3034處理的caspase-3活性增加4倍(圖4C)。此外,用3034處理的B16細(xì)胞在12 h和24 h的凋亡率均顯著高于ZT0587。STD-NMR分析表明化合物3034與MBP-Sb9結(jié)合,并且以低pH依賴的方式顯著增強(qiáng)(圖4D、圖4E)。當(dāng)pH值低至4時(shí),溶酶體是細(xì)胞內(nèi)酸性最強(qiáng)的部分。因此假設(shè)溶酶體的環(huán)境有利于化合物3034與Sb9的結(jié)合。結(jié)果顯示,Sb9和GrB共定位于B16細(xì)胞的溶酶體中(圖4F),并且化合物3034通過B16細(xì)胞以濃度依賴性方式降低Sb9-GrB的表達(dá)(圖4G)。有趣的是,化合物3034顯著增加LAMP1的表達(dá)和溶酶體擴(kuò)張,表明Sb9與溶酶體生物活性有關(guān)(圖4H)。
# Sb9小分子抑制劑治療抑制體內(nèi)黑色素瘤生長 #
與對(duì)照組相比,化合物3034的注射顯著減少植入小鼠側(cè)面的B16腫瘤的大小(圖5A)。與對(duì)照組相比,3034治療組的黑色素瘤切片中CD44+CD62L-CD8+細(xì)胞、GrB+CD8+細(xì)胞和IFNγ+CD8+細(xì)胞的數(shù)量均顯著高于對(duì)照組(圖5B-5D)。與對(duì)照組相比,3034治療組的切片中免疫抑制性Treg、TAM 和MDSC的水平顯著降低(圖5E-5G)。此外,在3034治療組的TME切片中發(fā)現(xiàn)IFNγ+CD4+細(xì)胞水平升高,IL-10+CD4+細(xì)胞和IL-10+CD8+細(xì)胞水平降低(圖5H)。為了評(píng)估化合物3034的抗腫瘤作用是否可應(yīng)用于人類疾病,研究者測試了NSG人源化A375小鼠模型的療效。與對(duì)照組相比,化合物3034顯著減少人黑色素瘤的大小。化合物3034在B16黑色素瘤中誘導(dǎo)GrB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖5I)。GranToxiLux分析證明了在用化合物3034處理的B16細(xì)胞中GrB的活性增加(圖5J、圖5K)。因此可得出結(jié)論:化合物3034可抑制黑色素瘤細(xì)胞中的Sb9,并使其易受GrB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。接下來用不同濃度的化合物3034處理B16-Sb9 KO細(xì)胞,評(píng)估其對(duì)Sb9的脫靶作用,結(jié)果未觀察到其他凋亡作用(圖5L)。此外,與對(duì)照組相比,未觀察到化合物3034對(duì)帶有B16-Sb9 KO腫瘤的Sb9 KO小鼠的抗腫瘤作用(圖5M)。為了進(jìn)一步評(píng)估其體內(nèi)毒性,將300 mg化合物3034每天兩次腹腔內(nèi)給藥14天。CBC結(jié)果顯示對(duì)照組和治療組之間的WBC、HGB和PLT沒有顯著差異。血清細(xì)胞表明兩組之間的AST、ALT、CRE和ALB水平相似。HE染色顯示化合物3034對(duì)小鼠的肝、腎、肺和心臟組織沒有毒性。
# Sb9抑制劑治療抑制體內(nèi)乳腺瘤生長 #
為了研究化合物3034對(duì)腫瘤基質(zhì)的作用,將MSC-WT細(xì)胞用化合物3034處理48 h。化合物3034顯著降低MSC-WT細(xì)胞產(chǎn)生的FN和Collagen-I(圖6A),并且顯著降低與B16細(xì)胞共培養(yǎng)的MSC-WT細(xì)胞產(chǎn)生的FN和Collagen-I(圖6B、圖6C)。乳腺癌的周圍基質(zhì)具有高度的免疫抑制作用。Sb9在人類原發(fā)性乳腺瘤細(xì)胞和TM內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)。因此,研究了化合物3034是否可用于治療植入4T1乳腺瘤的小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,化合物3034治療顯著降低4T1衍生瘤的大小。用化合物3034治療4T1腫瘤的MST顯著長于對(duì)照組。化合物3034的處理還導(dǎo)致基質(zhì)細(xì)胞和CAF的水平降低(圖6E-6J)。此外,在另外兩個(gè)體內(nèi)腫瘤模型(Renca腎瘤和LLC1肺瘤)中觀察到了化合物3034類似的抗腫瘤作用(圖6K、圖6L)。最后得出結(jié)論:化合物3034對(duì)Sb9的抑制作用在包括黑色素瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤(乳腺癌、肺癌和腎癌)中具有抗腫瘤作用。
總結(jié)全文,實(shí)驗(yàn)研究表明Sb9的基因消融不僅通過CL衍生的GrB,而且通過內(nèi)源性產(chǎn)生的GrB使腫瘤對(duì)殺傷更加敏感,共同導(dǎo)致了對(duì)小鼠癌癥的控制。在Sb9-KO小鼠體內(nèi)研究了Sb9在抗腫瘤宿主反應(yīng)中的作用,發(fā)現(xiàn)該小鼠對(duì)腫瘤的抵抗力增強(qiáng)。這些是TME中免疫抑制TAMs、MDSCs、Tregs和CAFs的存活受損導(dǎo)致抗腫瘤CL活性增加的結(jié)果。最后研究者開發(fā)了一種Sb9特異性小分子抑制劑3034,并且顯示小鼠通過對(duì)GrB的直接致敏和保護(hù)性免疫的激活來控制腫瘤的生長。