m6A研究思路又來了，今天解讀一篇發(fā)表在Molecular Cancer（IF：15.3）上題為“RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner”的文章。

01??前言

胰腺癌(PC)是一種起病隱匿、早期診斷困難、手術(shù)切除率低的胃腸道高惡性腫瘤，是世界上最常見的致命腫瘤之一。患者的5年生存率僅為8%，在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后甚至降至3%。因此，迫切需要闡明PC的分子和細(xì)胞機(jī)制，以達(dá)到診斷和治療干預(yù)的目的。N6-methyladenosine (m6A) 是真核生物mRNA中最豐富的可逆甲基化修飾，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討m6A去甲基化酶的作用ALKBH5與胰腺癌(PC)的關(guān)系。

02??研究結(jié)果

? ALKBH5表達(dá)減少對(duì)PC具有預(yù)測(cè)和預(yù)后價(jià)值

作者首先檢測(cè)了42例胰腺腫瘤和相應(yīng)非腫瘤性胰腺組織中ALKBH5的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與非癌對(duì)照組織相比，ALKBH5表達(dá)水平在PC中顯著下調(diào)；同時(shí)，在腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)m6A水平的上調(diào)；通過臨床結(jié)果分析，ALKBH5的低表達(dá)與患者的低生存率顯著相關(guān)。這些結(jié)果提示ALKBH5的下調(diào)可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

? ALKBH5在轉(zhuǎn)錄組調(diào)控的基礎(chǔ)上表現(xiàn)出抑癌活性

接下來，為了進(jìn)一步探究ALKBH5在胰腺癌中的作用，作者在BxPC-3細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)ALKBH5，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（BxPC-3/vector cells (Control) and BxPC-3/Lv-ALKBH5 cells (ALKBH5 overexpression)），RNA-Seq分析顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，在ALKBH5過表達(dá)的PC細(xì)胞中，共有367個(gè)差異表達(dá)基因 (204個(gè)上調(diào)基因，163個(gè)下調(diào)基因)，其中顯著上調(diào)的基因有PER1，F(xiàn)OXO1，CDC20，CCR5等。GO分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期阻滯，抗增殖和凋亡等相關(guān)基因在ALKBH5過表達(dá)后特異性上調(diào)，而與細(xì)胞存活和增殖相關(guān)的基因顯著下調(diào)。同時(shí)，KEGG通路分析顯示，與細(xì)胞周期和生長(zhǎng)密切相關(guān)的PI3K-AKT和P53信號(hào)通路顯著激活。

? ALKBH5抑制PC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

接下來，作者進(jìn)一步明確ALKBH5在胰腺癌中的作用。首先在胰腺癌細(xì)胞系中構(gòu)建了ALKBH5敲降和過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，然后通過CCK8、克隆形成、EDU染色、流式等一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)ALKBH5可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖；同時(shí)，劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)ALKBH5可以抑制胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲；與此相反，敲降A(chǔ)LKBH5會(huì)顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

? ALKBH5抑制PC動(dòng)物模型的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

在細(xì)胞水平證實(shí)了ALKBH5的作用后，作者進(jìn)一步在動(dòng)物水平進(jìn)行驗(yàn)證。通過構(gòu)建ALKBH5敲降和過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株、皮下異種移植、原位異種移植、穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶體內(nèi)成像、免疫組化等實(shí)驗(yàn)，證明了ALKBH5抑制PC動(dòng)物模型的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果一致。

? ALKBH5通過靶向PER1調(diào)控PC

在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中明確了ALKBH5的作用后，作者繼續(xù)探究具體作用機(jī)制。首先通過RNA-Seq和m6A-Seq聯(lián)合分析確定了PER1是ALKBH5下游靶標(biāo)，并且，PER1 mRNA的m6A修飾位點(diǎn)上有m6A讀取蛋白YTHDF2的結(jié)合位點(diǎn)。

? ALKBH5以m6A-YTHDF2依賴的方式增加PER1 mRNA水平

隨后，作者在ALKBH5敲降和過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株中，通過qPCR、MeRIP-qPCR、熒光素酶等實(shí)驗(yàn)，證明了ALKBH5以m6A-YTHDF2依賴機(jī)制調(diào)控PER1的表達(dá)。

? ALKBH5在PC組織中與PER1表達(dá)相關(guān)，具有抑瘤作用

接著作者利用臨床樣本及TCGA數(shù)據(jù)集分析和免疫熒光驗(yàn)證說明PER1與臨床胰腺癌患者的ALKBH5表達(dá)呈正相關(guān)。接著，作者通過 CCK-8、EdU and transwell 等回復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)的PER1抑制了PC的進(jìn)展，部分挽救了ALKBH5敲降導(dǎo)致的胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的異常。最后，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)的PER1水平可導(dǎo)致ATM依賴信號(hào)通路的激活，p-ATM、p-CHK2、p-CDC25C、pP53、P21和p-CDK1蛋白水平上調(diào)，并且免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明了ATM和PER1具有相互作用。

? PER1誘導(dǎo)的P53激活A(yù)LKBH5轉(zhuǎn)錄

以上實(shí)驗(yàn)其實(shí)就是一篇比較完整的文章了，但作者對(duì)機(jī)制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探究。研究發(fā)現(xiàn)，p53的異位表達(dá)，使得胰腺癌細(xì)胞ALKBH5水平顯著升高；同時(shí)，免疫熒光染色顯示P53的表達(dá)降低了BxPC-3細(xì)胞總RNA中m6A的水平。隨后，通過Chip、熒光素酶等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，p53可以通過與ALKBH5的啟動(dòng)子結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄。最后，TCGA數(shù)據(jù)集分析還發(fā)現(xiàn)，p53野生組中ALKBH5水平較高，而p53突變組中ALKBH5水平較低。

總結(jié)

ALKBH5缺失與胰腺癌臨床病理特征差及預(yù)后不良有關(guān)。過表達(dá)ALKBH5可降低PC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤的生長(zhǎng)，而ALKBH5敲降促進(jìn)PC進(jìn)程。PER1 mRNA的去甲基化及其水平的升高是ALKBH5以m6A-YTHDF2依賴的方式發(fā)揮作用。PER1誘導(dǎo)的p53上調(diào)和p53激活的ALKBH5轉(zhuǎn)錄可能反映了PC m6A修飾的反饋調(diào)控。

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