雙熒光素酶報告基因檢測
1、實驗原理
? ? ?熒光素酶(luciferase)是自然界中能夠產生生物熒光的酶的總稱,其中最有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶(Renilla luciferase)。由于兩種酶底物和發(fā)光顏色的區(qū)別,且在動物體內無內源性表達,使其在雙報告實驗中得到廣泛應用。
螢火蟲熒光素酶在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下,催化熒光素氧化,生成氧化熒光素,同時產生黃綠色光,波長540-600nm,一般檢測時選用560nm。
? ? ? 海腎熒光素酶只需要氧氣就可以催化腔腸素氧化產生藍光,波長460-540nm,一般檢測時選用460nm。
不同于綠色熒光蛋白(GFP)需要一定的光激發(fā)才能發(fā)光,且易淬滅;熒光素酶經過反應本身就可以自發(fā)熒光,并且只有在底物存在時才能發(fā)光。因此GFP只能用于標記或檢測反應是否發(fā)生,而熒光素酶報告實驗卻能通過熒光值定量分析熒光素酶的表達水平。
2、技術應用
? ? ? miRNA靶基因研究,轉錄因子研究,啟動子分析;
3、實驗步驟
? ? ?1.細胞鋪板;2.質粒共轉染;3.細胞酶產物裂解;4熒光檢測;5.結果分析?
4、結果展示
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客戶提供:細胞株(凍存株或培養(yǎng)細胞)及處理用的藥物,細胞培養(yǎng)基信息,細胞特殊處理方式
HYY提供:原始圖片、原始數據,完整實驗報告