近幾年來(lái)，腸道菌群的相關(guān)研究很是火熱，腸道微生物已被證明影響眾多疾病的進(jìn)程。2020年3月，美國(guó)克利夫蘭醫(yī)學(xué)中心的Stanley Hazen在Cell又發(fā)一篇腸道菌群與心血管疾病相關(guān)的研究，下面我們一起看下這篇文章的研究?jī)?nèi)容及其研究思路。

1、研究背景

心血管疾病（CVD）是全球死亡率較高的疾病之一。在過(guò)去的研究中發(fā)現(xiàn)，二型糖尿病（T2DM）病人有更高的CVD和重大心臟不良事件（MACE）風(fēng)險(xiǎn)，像血糖這樣的傳統(tǒng)T2DM監(jiān)測(cè)指標(biāo)并不能很好地預(yù)測(cè)CVD的風(fēng)險(xiǎn)。

2、研究目的

研究腸道菌群在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)機(jī)制。

3、方法和結(jié)果

作者首先通過(guò)代謝組學(xué)研究鑒定出苯丙氨酸被腸道微生物代謝為苯乙酰谷氨酰胺（PAGln），并鑒定出相關(guān)基因進(jìn)一步研究其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PAGIn可通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體增加血栓形成的潛力。

4、研究?jī)?nèi)容

非靶向代謝組學(xué)鑒定出PAGln與CVD相關(guān)

作者首先采用非靶向代謝組學(xué)對(duì)1162個(gè)受試者的血漿進(jìn)行分析，其中糖尿病患者257人，3年內(nèi)經(jīng)歷MACE患者116人。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一種未知的代謝物，其質(zhì)核比為265.1188的物質(zhì)在目標(biāo)個(gè)體中都存在，并且發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)在糖尿病患者和MACE患者中顯著升高，于是對(duì)該代謝物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)為PAGln。接下來(lái)的研究中作者通過(guò)采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合同位素示蹤法對(duì)另外4000個(gè)個(gè)體進(jìn)行靶向驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)PAGln與T2DM引起高風(fēng)險(xiǎn)CVD具有相關(guān)性。

腸道菌群在體內(nèi)參與PAGln和苯乙酰甘氨酸的形成

接下來(lái)作者研究了腸道微生物與PAGln生成的相關(guān)性。作者對(duì)人體不同條件下的PAGln水平進(jìn)行對(duì)比，其中包括人體基線水平（Pre-Abx）、7天復(fù)合抗生素處理（Abx）和3周恢復(fù)期（Post-Abx這三種情況），發(fā)現(xiàn)PAGln的水平在這三種情況下存在顯著差異，說(shuō)明腸道菌群的改變影響了人體中PAGln的生成。已有文獻(xiàn)報(bào)道苯乙酸（PAA）與谷氨酰胺（Gln）可在肝臟酶的作用下形成PAGln，細(xì)菌分解苯丙氨酸（Phe）產(chǎn)生PAA。PAA也可與甘氨酸（Gly）結(jié)合形成苯乙酰甘氨酸（PAGly）。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，人體中的PAGln含量更高，而小鼠中PAGly的含量高，在無(wú)菌鼠中這兩者的含量均減少，這也驗(yàn)證了微生物參與二者的合成。

PAGln增強(qiáng)血小板刺激誘導(dǎo)的鈣釋放和對(duì)多種激動(dòng)劑的反應(yīng)性

PAGln 水平與CVD之間具有正相關(guān)關(guān)系，作者推測(cè)PAGln 可能對(duì)血小板功能以及血管基質(zhì)具有潛在的影響。因此，作者研究了PAGln是否影響血小板對(duì)全血膠原表面的粘附。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAGln 和 PAGly 顯著影響血小板功能，增強(qiáng)血小板對(duì)膠原蛋白基質(zhì)的粘附力，以及鈣離子的血小板刺激依賴性上升和對(duì)激動(dòng)劑的聚集。

PAGln加速血小板凝集形成并增強(qiáng)體內(nèi)血栓形成潛力

作者使用 FeCl3 誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈損傷動(dòng)物模型驗(yàn)證了PAGln 和 PAGly 對(duì)小鼠體內(nèi)血塊形成的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAGln可加劇頸動(dòng)脈血栓形成。緊接著作者研究了有助于宿主內(nèi) PAGln / PAGly 生成的基因和基因是否可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)血小板功能和血栓形成潛力。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Phe主要由產(chǎn)孢梭菌代謝為PAA和苯丙酸（PPA），參與反應(yīng)的酶主要是由porA或fldH基因編碼。作者接下來(lái)構(gòu)建缺乏porA或fldH基因功能的產(chǎn)孢梭菌突變株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，porA主要影響PAA生成，而fldH基因主要影響PPA的生成。缺乏fldH基因可顯著影響血栓形成。

PAGln通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用

由于 PAGln 表現(xiàn)出與細(xì)胞的受體-配體相互作用的特性，接下來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)PAGIn可影響cAMP水平，PAGIn的結(jié)構(gòu)類似兒茶酚胺，預(yù)示PAGIn可能是通過(guò)相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體起作用。實(shí)驗(yàn)中作者進(jìn)一步采用SiRNA和阻斷劑，發(fā)現(xiàn)PAGln作用于G蛋白偶聯(lián)受體，包括α2A、α2B和β2-腎上腺素能受體（ADR），從而引起下游細(xì)胞反應(yīng)。

選擇性ADR抑制劑可減輕PAGln引起的血小板反應(yīng)過(guò)度和血栓生成

為了進(jìn)一步確認(rèn) PAGln 通過(guò) ADR 發(fā)揮作用，作者通過(guò)在人類胚胎腎細(xì)胞（HEK293）中單獨(dú)過(guò)表達(dá) α2A，α2B和β2 ADR進(jìn)行了功能研究，研究發(fā)現(xiàn)PAGln 可以通過(guò) α2A，α2B和β2 ADR誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答。之后作者使用抑制ADR的β受體阻斷藥，研究發(fā)現(xiàn)β受體阻斷藥可顯著減少PAGln誘導(dǎo)的高血栓形成風(fēng)險(xiǎn)。

總結(jié)：

首先作者通過(guò)采用非靶向代謝組對(duì)T2D和CVD個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，鑒定出與CVD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的未知代謝物PAGln；然后采用進(jìn)行靶向代謝組對(duì)該代謝物進(jìn)行驗(yàn)證；之后的研究發(fā)現(xiàn)PAGln的合成的與腸道微生物相關(guān)，并進(jìn)一步鑒定出關(guān)鍵基因fldH；動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明PAGln可增加血栓形成潛力，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞功能等相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PAGln是通過(guò)α2A、α2B和β2- ADR等G蛋白偶聯(lián)受體起作用。

●文章思路●

1、非靶向代謝組學(xué)鑒定差異代謝物，靶向代謝組學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證；

2、研究目標(biāo)代謝物與腸道微生物的相關(guān)性；

3、動(dòng)物模型驗(yàn)證；

4、研究相關(guān)基因；

5、探究分子機(jī)制。