Tumors attenuating the mitochondrial activity in T cells escape from PD-1 blockade therapy

今天跟大家分享日本慶應(yīng)大學(xué)醫(yī)學(xué)院去年3月發(fā)表在Elife上的一篇7.08分文章，探討關(guān)于腫瘤對(duì)PD-1免疫治療耐藥的機(jī)制。

文章摘要：當(dāng)前最熱門的免疫治療藥物——靶向PD-1受體的抑制性抗體，其治療原理是通過阻斷癌細(xì)胞表面PD-1或PD-1配體，使T細(xì)胞重新識(shí)別和殺滅腫瘤，但是這種療法只有不到一半的癌癥患者有效。作者提出兩種導(dǎo)致免疫治療無效的假設(shè)：癌細(xì)胞可能通過干擾T細(xì)胞的線粒體功能，或提高癌細(xì)胞表面的MHC I類蛋白表達(dá)來逃脫P(yáng)D-1阻斷治療。對(duì)此，作者在小鼠中開發(fā)了一種雙側(cè)腫瘤模型用來測(cè)試腫瘤是否釋放了免疫抑制因子：一側(cè)接種對(duì)PD-1阻斷免疫治療敏感腫瘤，另一側(cè)接種免疫治療不敏感腫瘤。如果不敏感的腫瘤只是躲避傳代的T細(xì)胞，它的存在就不會(huì)影響其他腫瘤。但是，如果不敏感腫瘤正在釋放阻止T細(xì)胞活化的分子，那么另一個(gè)腫瘤也可能對(duì)PD-1阻斷治療不敏感。通過這種動(dòng)物模型，作者將不敏感的腫瘤進(jìn)一步分為兩組：一組只是對(duì)局部的T細(xì)胞隱藏自己，而另一組釋放分子可以抑制全身的T細(xì)胞。這些抑制因子的成分尚不清楚，但進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明它們可能通過阻斷T細(xì)胞中的線粒體起作用，采用增強(qiáng)線粒體活性的藥物可以使抗PD-1治療不敏感的腫瘤恢復(fù)敏感性。

1. 根據(jù)免疫治療的療效，將腫瘤分為敏感腫瘤和不敏感腫瘤

研究者首先使用抗PD-L1單克隆抗體或Pdcd1 -/-小鼠模型，阻斷PD-1信號(hào)，來確定哪些腫瘤細(xì)胞株P(guān)D L1抗體敏感/響應(yīng)和不敏感/不響應(yīng)（圖1），MC38、GL261和MethA為敏感/響應(yīng)（responsive）腫瘤，而B16、LLC、Pan02和CT26為不敏感/不響應(yīng)（Unresponsive）腫瘤。

圖1 C57BL / 6N和BALB / c小鼠身上測(cè)試敏感和非敏感腫瘤

由于CD8 +細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）是PD-1阻斷療法期間的主要效應(yīng)細(xì)胞，因此作者按照?qǐng)D2中所示的周期，對(duì)宿主敏感腫瘤和不敏感腫瘤的T細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)圖2A。他們發(fā)現(xiàn)在敏感腫瘤組中，淋巴結(jié)（DLNs）中的總淋巴細(xì)胞和效應(yīng)記憶性CD8 + T細(xì)胞（CD62L lowCD44high，P3）均顯著增加，但在不敏感的腫瘤組在PD-1阻斷后，CD8 + T細(xì)胞沒有變化（圖2B和C）。此外，和ctrl IgG治療組相比，PD-1阻斷治療后，敏感腫瘤組比不敏感腫瘤組的中央記憶T細(xì)胞（CD62L高CD44高，P2門）和效應(yīng)記憶T細(xì)胞（CD62L低CD44高，P3門）更多。

在敏感腫瘤組中，PD-1阻斷后，CD8 +腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）也增加了（圖2D），Th1型細(xì)胞毒活性的T-bet和IFN-γ的表達(dá)增加（圖2E和F），但在不敏感腫瘤組中則沒有。在具敏感性腫瘤的組中，PD-1阻斷治療后，反映而在不敏感性腫瘤組中則沒有。在另一種遺傳背景（BALB / c）的小鼠中也獲得了類似的結(jié)果（參見原文）。綜上，根據(jù)抗腫瘤免疫治療的療效，將腫瘤分為敏感腫瘤和不敏感腫瘤。

圖2 PD-1阻斷顯著增加了應(yīng)答性小鼠mice with responsive中效應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量和功能，但在無應(yīng)答性腫瘤小鼠中卻沒有

2. PD-1阻斷后敏感腫瘤小鼠的效應(yīng)CD8 + T細(xì)胞具有更高的線粒體活性

由于CD8 + T細(xì)胞中的線粒體激活是CTL激活的標(biāo)志物。因此，為了確定對(duì)PD-1阻斷療法的敏感與T細(xì)胞中的線粒體活化之間是否存在關(guān)聯(lián)，我們使用Seahorse Analyzer（圖2-圖補(bǔ)編1A）。我們發(fā)現(xiàn)來自敏感（MC38和GL261）腫瘤宿主的DLN CD8 + T細(xì)胞具有較高的基礎(chǔ)呼吸，最大呼吸，備用呼吸能力（SRC）和受PD-1阻斷的ATP轉(zhuǎn)換，這在不敏感者中未觀察到（B16和LLC）荷瘤宿主（圖3A）。在BALB / c背景下的小鼠中獲得了相似的結(jié)果。此外，PD-1阻斷療法僅對(duì)敏感能力的荷瘤小鼠增加CD8 + TIL中線粒體超氧化物的產(chǎn)生（MitoSox）和細(xì)胞ROS（CellRos）（圖3B和C）。因此，PD-1阻斷在具有響應(yīng)能力的荷瘤小鼠中CD8 + T細(xì)胞的活性增加，與線粒體的激活有正相關(guān)。

圖3 PD-1阻斷顯著增加了應(yīng)答性小鼠中CD8+ T細(xì)胞的線粒體活性，但在無應(yīng)答性腫瘤中卻沒有

3.根據(jù)是否存在全身免疫抑制特性（SIP）對(duì)不敏感的腫瘤進(jìn)行分類

為了研究全身免疫抑制不敏感性腫瘤的機(jī)制，將不敏感性和敏感腫瘤分別接種在宿主的雙側(cè)（圖4A）。發(fā)現(xiàn)當(dāng)左側(cè)不敏感的腫瘤（LLC或Pan02）存在時(shí)，PD-1阻斷療法對(duì)右側(cè)敏感MC38的生長抑制效率低下（圖4B）。但是，當(dāng)不敏感的B16位于左側(cè)時(shí)，敏感的MC38或GL261被PD-1阻斷療法抑制，與左側(cè)沒有腫瘤的時(shí)候一樣有效（圖4B）。PD-1阻斷療法未抑制同一實(shí)驗(yàn)中左側(cè)不敏感腫瘤的大?。▍⒁娫模Ｒ虼?，我們推測(cè)不敏感的LLC和Pan02腫瘤可能釋放了免疫抑制因子，而不敏感的B16沒有。

圖4 不敏感的腫瘤可分為有或非全身免疫抑制腫瘤

按照相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，我們?cè)诹硪槐尘埃˙ALB / c）的小鼠中進(jìn)行了雙邊腫瘤實(shí)驗(yàn)，并確定CT26是SIP的不敏感性腫瘤（圖4C ）。綜上所述，我們將不敏感的腫瘤分為兩組：有或沒有全身免疫抑制特性（systemic immunosuppressive property，SIP）的腫瘤（表1）。

4.腫瘤來源的抑制性可溶性因子體內(nèi)抑制T細(xì)胞的線粒體活性

繼續(xù)用雙側(cè)腫瘤模型從線粒體激活的角度研究了左側(cè)的不敏感性腫瘤釋放的免疫抑制因子如何抑制右側(cè)敏感性腫瘤的免疫應(yīng)答（圖5A）。如圖5B所示，通過PD-1阻斷，在另一側(cè)SIP陰性B16的小鼠中，MC38一側(cè)的DLN中淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量增加，而在SIP陽性LLC在另一側(cè)時(shí)，則沒有。因此，在另一側(cè)有B16的情況下，在MC38一側(cè)存在PD-1阻斷作用，DLN CD8 + T細(xì)胞中的線粒體ROS產(chǎn)生、耗氧率OCR和ATP轉(zhuǎn)化也得到了增強(qiáng)，但當(dāng)SIP陽性LLC發(fā)生時(shí)，情況并非如此。接種在另一側(cè)（圖5C和D）。相比之下，PD-1阻斷治療并未改變不敏感的腫瘤側(cè)（B16和LLC）的線粒體激活狀態(tài)（圖5E和F）?？傊?，盡管LLC和B16均不敏感，但在PD-1阻滯治療期間可抑制全身的T細(xì)胞線粒體活化。

圖5 不敏感的腫瘤的免疫抑制因子抑制體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的線粒體反應(yīng)

5.免疫治療無效的B16腫瘤誘導(dǎo)了局部免疫耐受

我們懷疑沒有SIP的不敏感腫瘤可能無法通過獲得性免疫識(shí)別。我們比較了野生型和免疫缺陷小鼠（Rag2 -/-）之間的腫瘤生長。如圖所示圖6A與Rag2 -/-小鼠相比，野生型小鼠的敏感腫瘤（MC38，GL261和MethA）的生長顯著被抑制。相反，不敏感的腫瘤或多或少對(duì)獲得性免疫不敏感（圖6B）。雖然SIP陽性的不敏感性腫瘤（LLC和CT26）可以被獲得性免疫發(fā)現(xiàn)，但SIP陰性的不敏感性腫瘤（B16）被完全忽略（表1）?？赡苁怯捎谀[瘤的抗原較少和/或缺乏MHC I類表達(dá)產(chǎn)生的免疫耐受。甚至在受到IFN-γ刺激后，B16也不表達(dá)I類MHC，但SIP陽性腫瘤卻表達(dá)了（圖6C和D）。換句話說，B16通過采用局部免疫耐受而不是SIP導(dǎo)致不敏感。

這些數(shù)據(jù)表明在SIP陰性的腫瘤中不敏感性的機(jī)制之一是缺乏I類MHC表達(dá)，并且表明抑制因子的消除僅在具有SIP的不敏感性腫瘤中促進(jìn)PD-1阻斷治療功效的增強(qiáng)。

圖6? B16中沒有MHC I類表達(dá)

6.SIP陽性腫瘤的免疫抑制性小分子的分泌

T細(xì)胞增殖：為了檢查不敏感的腫瘤是否釋放免疫抑制因子，在從敏感和不敏感性腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中收集到的上清液存在的情況下，用抗（CD3 + CD28）mAb包被的珠子刺激了未成熟的CD8+ T細(xì)胞（圖7A）。增殖測(cè)定（胸苷摻入和Ki67檢測(cè)測(cè)定）表明，在LLC或CT26的上清液存在下，T細(xì)胞增殖受到顯著抑制，而在B16，GL261或MethA的上清液存在下則沒有（圖7B 和 圖7－圖補(bǔ)編1A和B）。稀釋上清液后恢復(fù)T細(xì)胞增殖，進(jìn)一步證明了LLC上清液中可溶性因子的抑制作用（參見原文）。并且，不但部分小鼠細(xì)胞系有SIP因子陽性，而且部分人細(xì)胞系也有（參見原文）。

T細(xì)胞線粒體：此外，與B16和GL261上清液相比，LLC上清液可顯著抑制線粒體的ROS和線粒體電位（圖7C）。與B16和GL261相比，在LLC上清液存在下培養(yǎng)48小時(shí)的CD8+T細(xì)胞中，氧消耗率OCR和糖酵解——細(xì)胞外酸化率（ECAR）顯著降低（圖7D和E）。為了闡明這種線粒體抑制是直接抑制還是間接抑制，T細(xì)胞與LLC上清液的共培養(yǎng)2小時(shí)，線粒體的激活參數(shù)被立即抑制（圖7F）。SIP因子可以在2小時(shí)內(nèi)抑制B細(xì)胞的線粒體，顯示出這種抑制作用是廣譜的（圖7補(bǔ)充圖3B）。這些結(jié)果表明，從SIP陽性腫瘤中釋放的免疫抑制因子可直接抑制線粒體功能。

為了了解抑制因子的分子特性：作者用熱滅活處理使蛋白質(zhì)成分變性，并采用了葡聚糖包被的木炭（DCC）處理來吸附培養(yǎng)物上清液中的小分子。如圖所示圖7G 和 圖7－圖補(bǔ)遺1E，LLC和CT26培養(yǎng)上清液的熱失活并未消除其抑制活性，而使用DCC處理去除低分子量化合物則消除了其抑制活性，這表明抑制因子可能由非蛋白質(zhì)小分子組成。我們進(jìn)一步將上清液分為'A級(jí)組分（

7.苯扎貝特與PD-1阻斷劑的組合可改善患有SIP陽性腫瘤的小鼠的存活率

作者進(jìn)一步在體外驗(yàn)證線粒體激活藥物苯扎貝特是否可以逆轉(zhuǎn)SIP陽性腫瘤的免疫抑制作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苯扎貝特可以逆轉(zhuǎn)體外LLC培養(yǎng)上清液中抑制因子對(duì)未成熟的CD8 + T細(xì)胞線粒體抑制，線粒體功能得到了顯著恢復(fù)（圖8A）。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)LLC荷瘤小鼠采用苯扎貝特和PD-1阻斷聯(lián)合治療（圖8B）可增強(qiáng)對(duì)LLC腫瘤的療效（圖8C）。不過聯(lián)合治療無法增強(qiáng)對(duì)B16腫瘤的療效（圖8C）。我們?cè)贐ALB / c背景下的腫瘤中觀察到了相似的結(jié)果（結(jié)果參見原文）。因此，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)共同表明，通過線粒體活化化學(xué)物質(zhì)苯扎貝特可增強(qiáng)SIP陽性的不敏感性腫瘤的療效。

圖8 苯扎貝特通過激活線粒體克服了對(duì)SIP陽性腫瘤的免疫抑制并提高了存活率

點(diǎn)評(píng)

這篇文章作者巧妙的設(shè)計(jì)雙側(cè)不同腫瘤實(shí)驗(yàn)，將腫瘤分為有或沒有釋放免疫抑制因子誘導(dǎo)免疫耐受的腫瘤。不過免疫抑制因子的機(jī)制探討部分，對(duì)T細(xì)胞線粒體的抑制功能并不明顯。因此針對(duì)線粒體激活功能的藥物聯(lián)合使用并沒有明顯增強(qiáng)療效。