正在進(jìn)行的COVID-19大流行已導(dǎo)致全球179萬(wàn)人死亡，在許多國(guó)家仍未得到控制，造成了緊急的全球危機(jī)，冠狀病毒是一種正鏈RNA病毒，在人類(lèi)流行的季節(jié)性冠狀病毒會(huì)引起輕微的、類(lèi)似普通感冒的癥狀。在動(dòng)物中傳播新型冠狀病毒已突破物種屏障，造成人類(lèi)感染。21世紀(jì)，三次引人注目的冠狀病毒疫情暴發(fā)，表明該病毒家族具有跨物種、迅速傳播并奪去無(wú)數(shù)生命。SARS-CoV-2大流行推動(dòng)了冠狀病毒研究。因此，迫切需要更好地理解SARS-CoV-2生物學(xué)和識(shí)別潛在治療靶點(diǎn)，在冠狀病毒生物學(xué)更廣泛背景下獲取和解釋這些知識(shí)，為未來(lái)可能爆發(fā)的疫情做準(zhǔn)備也至關(guān)重要。

2021年 2月10日，洛克菲勒大學(xué)病毒學(xué)和傳染病實(shí)驗(yàn)室Hoffmann 課題組在Cell Host & Microbe（IF 15.923）在線(xiàn)發(fā)表了題為 Functional interrogation of a SARS-CoV-2 host protein interactome identifies unique and shared coronavirus host factors? 的研究論文。

一、結(jié)果展示

? CRISPR-Cas9文庫(kù)篩選SARS-CoV-2感染必需宿主蛋白

前期研究利用SARS-CoV-2的26個(gè)蛋白分別轉(zhuǎn)染到KEK293T，免疫共沉淀鑒定332個(gè)互作宿主蛋白。根據(jù)篩選到的互作蛋白定制個(gè)性化CRISPR-Cas9文庫(kù)，靶向332個(gè)基因，共3944條sgRNAs（含314條對(duì)照和310條參與細(xì)胞存活和增殖），進(jìn)一步篩選出SARS-CoV-2感染和誘導(dǎo)病變的必需因子（圖1A）。為了確定必需宿主因子對(duì)溫度依賴(lài)的差異，作者分別在33℃和37℃條件下（模擬上呼吸道和下呼吸道），將CRISPR-Cas9文庫(kù)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到Huh-7.5 肝癌細(xì)胞（表達(dá)ACE2（SARS-CoV-2細(xì)胞受體）和TMPRSS2（SARS-CoV-2進(jìn)入細(xì)胞的）），經(jīng)過(guò)嘌呤霉素和病毒感染篩選獲得基因組DNA，通過(guò)高通量測(cè)序（圖1B）及生信分析，分別獲得42（33℃）和43（37℃）個(gè)候選基因顯著影響SARS-CoV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；其中，21（33℃）和23（37℃）個(gè)候選基因被認(rèn)為是潛在的宿主因子促進(jìn)SARS-CoV-2-induced細(xì)胞死亡（紫色）；然而21（33℃）和20（37℃）個(gè)是病毒生命周期拮抗劑的基因（橘色）（圖1C，1D），結(jié)果表明SARS-CoV-2誘導(dǎo)的互作蛋白對(duì)于病毒感染或病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是必不可少的。對(duì)2個(gè)溫度下篩選的富集和耗竭基因取交集，分別獲得不同的基因列表（圖1E）。

圖1 CRISPR篩選SARS-CoV-2相互作用蛋白

? 多種冠狀病毒感染篩選宿主必需基因

同一家族的不同病毒感染可能需要共同的和特異的宿主基因參與，從功能上區(qū)分這些需求，對(duì)病毒宿主生物學(xué)有一個(gè)全面的了解；從應(yīng)用角度，能夠鑒定冠狀病毒共同作用的靶點(diǎn)。研究者增加了3個(gè)冠狀病毒HCoV-229E, HCoV-NL63和 HCoV-OC43 的感染篩選（圖2A）。四個(gè)冠狀病毒篩選獲得共同的顯著富集基因子集，比如Rab GTPases，HOPS 復(fù)合物的組成部分，EMC1，GPI 錨定生物合成是冠狀病毒感染和誘導(dǎo)病變必需的宿主基因（圖2B-2E）。

圖2 不同冠狀病毒感染篩選病毒特異和公共的宿主因子

通過(guò)siRNA分別干擾候選基因表達(dá)，檢測(cè)病毒抗原(N蛋白)或者病毒復(fù)制中期的雙鏈RNA，結(jié)果表明這些基因的一個(gè)子集是病毒復(fù)制和傳播所必需的。隨后研究者選擇A549進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明，分別敲低多個(gè)靶基因顯著抑制病毒感染A549細(xì)胞，進(jìn)一步證明了篩選宿主互作基因的有效性和普遍性（圖3B-3C）。

圖3 高度可信的SARS-CoV-2感染宿主蛋白驗(yàn)證

? 篩選互作蛋白與具有功能的互作蛋白

接下來(lái)，研究者以病毒餌蛋白為中心，將CRISPR篩選的靶蛋白繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖4A）。隨后探索了對(duì)于給定的誘餌蛋白，宿主靶蛋白數(shù)量是否可以預(yù)測(cè)功能相互作用的百分比，作者使用超幾何檢驗(yàn)測(cè)試了每種誘餌蛋白在功能性靶蛋白中的富集情況，結(jié)果表明Orf9c誘餌蛋白在功能性互作蛋白中被顯著富集（圖4B）。有趣的是，與許多宿主蛋白互作的誘餌蛋白（如Orf8，Nsp13）有相對(duì)較少的功能性互作靶蛋白；然而Nsp7，Nsp8，Orf9c誘餌蛋白有較多的功能性互作靶蛋白。假定的SARS-CoV-2相互作用332個(gè)互作蛋白中，87個(gè)靶蛋白為SARS-CoV-2感染必需的；與SARS-CoV-2相互作用的有些靶蛋白，對(duì)一種或多種其他冠狀病毒感染是必要的，但對(duì)SARS-CoV-2的感染不是必要的，如DDX10, RPL36,GNG5和CYB5B （圖2E-4A）。

結(jié)果表明，在功能性需要的宿主蛋白中，宿主與病毒相互作用蛋白被富集，但物理結(jié)合和功能需要之間的關(guān)系并不嚴(yán)格一致。

圖4 CRISPR篩選的網(wǎng)絡(luò)覆蓋圖

二、結(jié)論

綜上所述，該研究通過(guò)CRISPR-Cas9文庫(kù)（靶向332個(gè)SARS-CoV-2互作蛋白）篩選不同冠狀病毒感染必需的互作蛋白和功能性蛋白，展示了不同冠狀病毒感染宿主細(xì)胞在Rab GTPase和GPI錨點(diǎn)生物合成存在病毒特異性差異，以及參與膽固醇穩(wěn)態(tài)的多種公共互作因子的鑒定,為攔截和治療COVID-19的藥物研發(fā)提供信息并為未來(lái)的冠狀病毒暴發(fā)做好準(zhǔn)備。