一、研究背景

越來(lái)越多的研究表明，ROS扮演著抗腫瘤的角色，內(nèi)源性和外源性的抗氧化劑可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。Nrf2（NF-E2-related factor 2）是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，受Keap1的調(diào)控，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件ARE（antioxidant response element）相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和II相解毒酶的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子BACH1（the transcription factor BTB and CNC homology1，BTB和CNC同源物1）與Nrf2同屬b-ZIP家族蛋白，可與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ARE，從而抑制抗氧化基因的表達(dá)，如HMOX-1（編碼解毒酶血紅素加氧酶1，HO-1，可降解游離血紅素），NQO1, （NAD(P)脫氫酶，quinone 1）。細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下，血紅素結(jié)合蛋白氧化釋放游離血紅素，游離血紅素可使BACH1泛素化降解，從而使抗氧化相關(guān)基因表達(dá)。

肺癌是一種死亡率很高的癌癥，且大多數(shù)患者死于癌癥轉(zhuǎn)移。因此，了解控制肺癌轉(zhuǎn)移的基本機(jī)制對(duì)于臨床治療至關(guān)重要。然而，盡管三分之一的肺癌患者中有NRF2或KEAP1突變，但內(nèi)源性和外源性抗氧化劑在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用尚未被探索。

二、研究結(jié)果

作者首先構(gòu)建肺癌小鼠模型Kras2LSL/+ and Kras2LSL/+Trp53fl/fl mice (簡(jiǎn)稱(chēng)K和KP)，用低濃度的Cre-adenovirus誘導(dǎo)原發(fā)性肺癌，并且在小鼠的飲食當(dāng)中加入抗氧化劑NAC（n-乙酰半胱氨酸）或VitE（維生素E），喂養(yǎng)一周。發(fā)現(xiàn)抗氧化劑喂養(yǎng)的小鼠發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率比control高6-7倍，且誘導(dǎo)遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移。

進(jìn)一步，作者用 control 和 NAC-treated K小鼠建立原代肺癌細(xì)胞系（mTC 和mTN），發(fā)現(xiàn)不管是在體內(nèi)還是體外，mTN細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著高于mTC細(xì)胞，另外在補(bǔ)充數(shù)據(jù)中，兩株細(xì)胞的增殖速率相似。

抗氧化劑為什么能促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移呢？

作者通過(guò)RNA-seq分析mTC和mTN細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化，鑒定出1025個(gè)差異基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其中267個(gè)基因有NRF2-binding motif, 310個(gè)基因有BACH1-binding motif。qPCR檢測(cè)BACH1 和 NRF2 靶向基因，發(fā)現(xiàn)在mTN細(xì)胞中BACH1的表達(dá)輕微上升，其已知的下游基因Nqo1表達(dá)下降，新鑒定的下游基因Pkp3、Mmp1a（細(xì)胞侵襲相關(guān)）表達(dá)上升。隨后，發(fā)現(xiàn)在mTN細(xì)胞中，BACH1的蛋白水平顯著上調(diào)（說(shuō)明蛋白穩(wěn)定性增加）；相反，氧化劑可降低BACH1的蛋白水平。

背景知識(shí)已經(jīng)介紹，free heme（游離血紅素）可通過(guò)泛素化降解BACH1，作者發(fā)現(xiàn)，NAC處理后free heme水平下降，H2O2處理后表達(dá)上升。同時(shí)，在加入外源血紅素后（Hemin，血紅素衍生物），BACH1蛋白水平下降。并且，使用蛋白酶體相關(guān)抑制劑可以消除Hemin誘導(dǎo)的BACH1降解。

那BACH1在mTN細(xì)胞中起著什么作用呢？調(diào)控轉(zhuǎn)移？

在KO BACH1之后，mTN細(xì)胞的高侵襲能力和肺轉(zhuǎn)移能力被逆轉(zhuǎn)；為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，作者使用 CRISPR-SAM (synergistic activation mediator)來(lái)提高mTC細(xì)胞中內(nèi)源性BACH1的表達(dá)，BACH1的表達(dá)增加后，mTC細(xì)胞的侵襲、遷移和肺轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)。說(shuō)明BACH1是抗氧化劑誘導(dǎo)的肺癌轉(zhuǎn)移所必須，且在抗氧化劑缺失時(shí)，也可誘導(dǎo)肺癌轉(zhuǎn)移。

BACH1下游的哪些靶基因促進(jìn)了腫瘤轉(zhuǎn)移呢？

作者通過(guò)BACH1 Chip-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)在mTN細(xì)胞中，代謝過(guò)程顯著改變，糖酵解關(guān)鍵酶HK2（己糖激酶）和GAPDH（磷酸甘油醛脫氫酶）表達(dá)顯著上調(diào)，且進(jìn)一步證明了BACH1可與HK2和GAPDH啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。

隨后，作者進(jìn)一步分析RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在mTN細(xì)胞中，糖酵解途徑其它相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平也顯著上調(diào)，如PFKFB3（編碼磷酸果糖激酶）、SLC16A1（編碼乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，MCT1）；同時(shí)檢測(cè)糖酵解相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，在mTN細(xì)胞中，糖酵解速率加快，耗氧率下降，葡萄糖攝取和乳酸分泌能力增強(qiáng)；并且，在mTC和mTN細(xì)胞中，通過(guò)過(guò)表達(dá)和敲除BACH1做了進(jìn)一步驗(yàn)證。

接著，作者進(jìn)一步探究細(xì)胞侵襲和糖酵解表型改表之間是否有聯(lián)系。作者發(fā)現(xiàn)，在mTC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HK2后，細(xì)胞的糖酵解速率加快，遷移和肺轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)；于此相反，在mTN細(xì)胞中過(guò)表達(dá)G6PC3（葡萄糖6磷酸酶，糖異生途徑相關(guān)酶）后，細(xì)胞的糖酵解速率減慢，遷移和肺轉(zhuǎn)移能力下降。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在mTN細(xì)胞中，糖酵解來(lái)源ATP和總的ATP產(chǎn)生速率都要顯著高于mTC細(xì)胞，且總的ATP水平也顯著增加。說(shuō)明抗氧化劑可以使細(xì)胞糖酵解速率加快，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。

那么抑制糖酵解相關(guān)途徑酶對(duì)細(xì)胞遷移有什么影響呢？

作者使用抑制劑抑制糖酵解途徑相關(guān)酶活性，發(fā)現(xiàn)2-DG，LND（HK2抑制劑）、DCA（丙酮酸脫氫酶抑制劑）、3-BP（GAPDH抑制劑）、AZD3965（MCT1抑制劑）都可以逆轉(zhuǎn)抗氧化劑所誘導(dǎo)的遷移。

三、總結(jié)

腫瘤若想快速進(jìn)展必須克服氧化應(yīng)激障礙。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)，膳食中添加抗氧化劑或NRF2激活內(nèi)源性抗氧化劑可以降低氧化應(yīng)激，可以促進(jìn)早期肺癌的進(jìn)展，但其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用尚不明確。該研究證明，長(zhǎng)期補(bǔ)充抗氧化劑n -乙酰半胱氨酸和維生素E可促進(jìn)kras驅(qū)動(dòng)的肺癌轉(zhuǎn)移。抗氧化劑通過(guò)降低游離血紅素水平來(lái)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子BACH1，從而刺激肺癌轉(zhuǎn)移；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，BACH1通過(guò)激活HK2和GAPDH的轉(zhuǎn)錄，增加葡萄糖攝取、糖酵解和乳酸分泌，從而刺激小鼠和人肺癌細(xì)胞糖酵解依賴(lài)性轉(zhuǎn)移；靶向抑制BACH1可使得糖酵解正常，預(yù)防抗氧化劑誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移；增加內(nèi)源性BACH1表達(dá)促進(jìn)糖酵解，促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移。