本期向大家介紹一篇在Molecular Cancer最新發(fā)布的關(guān)于三陰性乳腺癌中CircNR3C2通過海綿化miR-513a-3p促進(jìn)HRD1介導(dǎo)的腫瘤抑制作用，文章題目：CircNR3C2 promotes HRD1-mediated tumor-suppressive effect via sponging miR513a-3p in triple-negative breast cancer，原文地址：10.1186/s12943-021-01321-x，影響因子：15.302，作者：蘇東明教授（南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院）。

乳腺癌常被稱為“粉紅殺手”，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位，男性乳腺癌較為少見。乳腺癌根據(jù)基因表達(dá)模型不同主要分為四個(gè)不同的分子亞型，其中三陰性亞型乳腺癌被報(bào)道最多的一種亞型。原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致死亡的主要原因，上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移是乳腺癌擴(kuò)散過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在擴(kuò)散的過程中，波形蛋白的表達(dá)顯著升高，表明了波形蛋白在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中起到重要的作用，其中翻譯后修飾，如磷酸化、乙?；约胺核鼗紩?huì)影響波形蛋白結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。最新研究報(bào)道稱E3泛素連接酶TRIM56和RNF208通過誘導(dǎo)波形蛋白的多泛素化介導(dǎo)蛋白酶體降解，分別減少卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本文作者也發(fā)現(xiàn)了一種E3泛素連接酶HRD1通過相關(guān)作用來減少乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，作者通過本文闡述E3泛素連接酶HRD1如何通過相關(guān)作用機(jī)制來對(duì)腫瘤的抑制作用。

結(jié)果展示

? HRD1在三陰性乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞系中顯著低表達(dá)

作者為了探討HRD1在不同乳腺癌亞型中的表達(dá)模式，用一些臨床樣本組織和相關(guān)癌細(xì)胞，運(yùn)用了Immunoblotting、immunohistochemical staining 和 RT-qPCR研究方法，結(jié)果表明：相對(duì)于乳腺癌其他三種亞型組織樣本和細(xì)胞樣本，HRD1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)水平顯著低于其他幾種亞型乳腺癌（如圖下圖A-I），初步說明了HRD1在三陰性乳腺癌中起到至關(guān)重要的蛋白分子。

? HRD1表達(dá)與波形蛋白（Vimentin）表達(dá)負(fù)相關(guān)

相關(guān)報(bào)道HRD1是一種E3泛素連接酶，以及一種在乳腺癌中起到至關(guān)重要的蛋白分子- Vimentin，作者為了研究HRD1的功能以及和Vimentin之間的作用機(jī)制，構(gòu)建了過表達(dá)HRD1載體，瞬轉(zhuǎn)到MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HRD1組中，Vimentin的蛋白表達(dá)水平顯著降低于對(duì)照組。作者還通過收集60例臨床組織樣本，通過免疫組化觀察兩種蛋白分子的表達(dá)情況，結(jié)果表明兩種蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（如下圖A-F）。

? 波形蛋白的降解需要HRD1泛素化作用

根據(jù)結(jié)果2，作者大膽猜測(cè)HRD1可能通過泛素化機(jī)制對(duì)波形蛋白起到降解作用。為了證實(shí)這種猜測(cè)，選MDA-MB-231和BT549兩種細(xì)胞，過表達(dá)HRD1，免疫印跡分析結(jié)果表明，波形蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著減少，同時(shí)也觀察細(xì)胞中其他的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記蛋白的表達(dá)量沒有發(fā)生變化。用環(huán)己酰亞胺處理細(xì)胞后進(jìn)行WB，結(jié)果表明HRD1主要是通過蛋白酶對(duì)波形蛋白起到快速降解作用。作者還通過免疫共沉淀、免疫熒光染色以及Co-IP試驗(yàn)方法證實(shí)了HRD1和波形蛋白存在著相互結(jié)合作用。此外，基于泛素化發(fā)生在目標(biāo)蛋白的賴氨酸殘基這個(gè)事實(shí)，作者在波形蛋白的頭部結(jié)構(gòu)域中鑒定出一個(gè)賴氨酸殘基，為了檢查該殘基對(duì)HRD1介導(dǎo)的波形蛋白的泛素化是否至關(guān)重要，通過用丙氨酸替代在不同物種中進(jìn)化保守的賴氨酸殘基生成波形蛋白突變體，當(dāng)野生型波形蛋白通過HRD1進(jìn)行多泛素化時(shí)，波形蛋白突變體并沒有進(jìn)行多泛素化（如下圖A-K）。

? HRD1通過對(duì)波形蛋白降解起到抑制腫瘤形成和上皮介質(zhì)轉(zhuǎn)化

作者繼續(xù)探討HRD1通過對(duì)波形蛋白降解起到抑制腫瘤形成的機(jī)制。作者通過CCK8和單克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)HRD1能夠抑制細(xì)胞增殖和分化，相反同時(shí)過表達(dá)波形蛋白能挽救這種現(xiàn)象。作者還進(jìn)行了在相關(guān)三陰性乳腺癌中過表達(dá)HRD1，細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力都顯著減弱，劃痕實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了細(xì)胞的侵入能力顯著下降（如下圖A-K）。

? CircNR3C2和miR-513a-3p被預(yù)測(cè)起到調(diào)控HRD1的作用

作者為了找到和HRD1相關(guān)的circRNA和miRNA分子，在GEO數(shù)據(jù)庫上下載關(guān)于乳腺癌的臨床信息，應(yīng)用生物信息學(xué)手段找到和HRD1相關(guān)TOP 10的circRNA，作者接下來通過GO和KEGG的富集分析，也找到了和HRD1作用相關(guān)的miRNA，最后通過在線網(wǎng)址預(yù)測(cè)能相互作用的circRNA和miRNA，確定了circNR3C2和miR-513a-3p作為后續(xù)研究分子（如下圖A-I）。

? CircNR3C2在三陰性乳腺癌顯著下調(diào)

CircNR3C2核酸序列全長(zhǎng)1760bp，由基因NR3C2第二個(gè)外顯子剪接而形成。分別提取三陰性乳腺癌組織樣和其他亞型乳腺癌組織樣RNA，QPCR結(jié)果表明：相對(duì)于其他亞型乳腺癌組，CircNR3C2和HRD1在三陰性乳腺癌組織中的mRNA表達(dá)水平顯著降低。通過FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CircNR3C2存在細(xì)胞質(zhì)中（如下圖A-H）。

? 過表達(dá)circNR3C2通過海綿吸附miR-513a-3p促進(jìn)HRD1上調(diào)

通過生物信息學(xué)分析結(jié)果可知circNR3C2和miR-513a-3p相互作用能調(diào)控HRD1在乳腺癌中的表達(dá)。通過在MDA-MB-231細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)miR-513a-3p mimic或者inhibitor，應(yīng)用免疫印跡和RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中HRD1蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著減少（mimic）或者增多（inhibitor）。作者為了驗(yàn)證miR-513a-3p和HRD1的作用關(guān)系，設(shè)計(jì)了與miR-513a-3p結(jié)合位點(diǎn)突變的HRD1序列和正常結(jié)合位點(diǎn)序列分別進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-513a-3p mimic或者inhibitor可以顯著減少或者增加熒光強(qiáng)度。同時(shí)，過表達(dá)circNR3C2同樣能增加HRD1的mRNA表達(dá)水平或者蛋白表達(dá)水平但是不能顯著減少miR-513a-3p的mRNA水平。作者通過RNA pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circNR3C2和miR-513a-3p相互結(jié)合位點(diǎn)，同樣設(shè)計(jì)了突變型和野生型circNR3C2雙熒光素酶質(zhì)粒進(jìn)行熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明miR-513a-3p inhibitor能顯著減少熒光強(qiáng)度。所以通過以上的一系列結(jié)果說明circNR3C2、miR-513a-3p和HRD1的相互關(guān)系能夠影響乳腺癌的發(fā)生。

? 通過過表達(dá)circNR3C2引起波形蛋白的降解從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

根據(jù)以上的結(jié)果，作者猜測(cè)過表達(dá)circNR3C2能夠影響波形蛋白在三陰性乳腺癌細(xì)胞的穩(wěn)定性。通過在三陰性乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)circNR3C2，觀察波形蛋白的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組過表達(dá)circNR3C2能夠促進(jìn)波形蛋白的翻譯水平提高，而mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。在細(xì)胞功能驗(yàn)證中，作者通過CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)來研究過表達(dá)circNR3C2對(duì)細(xì)胞增殖的影響，以及通過劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)研究過表達(dá)circNR3C2對(duì)細(xì)胞侵襲的影響，結(jié)果表明過表達(dá)circNR3C2能夠抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低。最后，作者建立了一個(gè)體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移模型，講用不同處理的MDA-MB-231細(xì)胞尾靜脈注射免疫缺陷裸鼠體內(nèi)，過表達(dá)circNR3C2組肺轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)顯著減少（如下圖A-I）。

總結(jié)

本文作者闡明了一種新的腫瘤抑制因子HGD1通過誘導(dǎo)多泛素化介導(dǎo)波形蛋白的蛋白酶體降解，作用機(jī)制主要是通過circNR3C2海綿吸附miR-513a-3p促進(jìn)HRD1上調(diào)，從而起到對(duì)波形蛋白的蛋白酶體降解作用，最終抑制三陰性乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。