盡管RT-PCR檢測病毒RNA技術(shù)，已經(jīng)成為大多數(shù)國家和地區(qū)對新冠患者排查的常規(guī)手段，也是COVID-19病例診斷的金標準，但仍然需要血清學(xué)方法來表征SARS-CoV-2的體液反應(yīng)。血清學(xué)檢測可以用來追蹤已經(jīng)清除感染的個體（尤其是輕度或無癥狀個體）的傳播，有助于了解病毒的流行病學(xué)，并將新冠免疫人員布置在醫(yī)院的關(guān)鍵前線位置。同時，評估新型疫苗臨床研究效果也必須通過血清學(xué)方法驗證。SARS-CoV-2是有包膜的單鏈RNA病毒，包含四個結(jié)構(gòu)蛋白：膜（M），包膜（E），刺突（S）和核衣殼（N），其中N和S蛋白是最具免疫原性的病毒抗原，而只有S特異性抗體才能介導(dǎo)病毒中和。因此，針對S蛋白的特異性抗體反應(yīng)是血清學(xué)檢測的首選參數(shù)。在這里，小編分享兩種無需使用中和抗體檢測商業(yè)試劑盒或產(chǎn)品也能檢測新冠抗體中和能力測定的方法。

1、抑制細胞融合測定法

穩(wěn)轉(zhuǎn)表達β-半乳糖苷酶的α亞基的293T細胞瞬轉(zhuǎn)SAR-COV-S蛋白基因，穩(wěn)轉(zhuǎn)表達編碼β-半乳糖苷酶的ω亞基的293T細胞瞬轉(zhuǎn)人ACE2基因，轉(zhuǎn)染后2天，將表達S蛋白的細胞和表達ACE-2的細胞以1：1的比例混合，同時加入待測試的抗體樣本，并在37℃下孵育3小時后，-80℃凍融裂解細胞，用化學(xué)定量法檢測β半乳糖苷酶活性。（圖1）

圖1 抑制細胞融合測定法原理

如圖2所示，將表達S蛋白的細胞與不同的Ig抗體一起孵育，并與表達ACE2的細胞混合后，測定報告基因β-gal的活性作為細胞融合的指標。用實驗數(shù)據(jù)的最佳擬合曲線計算IC 50值。其中ACE2-Ig有效抑制SARS-CoV-2 S蛋白介導(dǎo)融合，IC 50值為0.65μg·ml -1。mACE2-Ig對SARS-CoV-2的IC 50值0.48μg·ml -1。對照TIGIT-Fc在該測定中未顯示任何抑制作用。表明ACE2-Ig和mACE2-Ig均表現(xiàn)出對SARS-CoV-2 S蛋白的有效中和活性。

圖2 2種Ig抗體有效地抑制了SARS-CoV-2-S蛋白表達細胞與ACE2蛋白表達細胞的融合

同理，今年清華大學(xué)報道，用雙熒光素酶作為報告基因的細胞融合實驗，測試了兩種單克隆抗體對登革熱病毒感染的抗細胞融合活性（圖3）。證明無需β半乳糖苷酶試劑，雙熒光素酶也可以作為細胞融合實驗的報告基因。

圖3 用雙熒光素酶作為報告基因的細胞融合實驗原理

2、流式檢測法

只需要準備表達病毒抗原的工具細胞株、檢測IgG或IgM的流式二抗、中和抗體標準品或抗原配體的標準品即可開展實驗。而且流式可以圈出目標細胞繼續(xù)后續(xù)定量分析，因此比間接法的細胞融合實驗更靈敏。經(jīng)PCR確診的SARS-CoV-2感染患者標本中，與市售的化學(xué)發(fā)光免疫分析CLIA和ELISA檢測試劑相比，對201 COVID-19血清的分析靈敏度最高。

表1比較3種方法檢測COVID-19 PCR陽性患者的血清樣品抗體的靈敏度

pCG1_CoV_2019-S質(zhì)粒：編碼密碼子優(yōu)化的SARS-CoV-2 S重組蛋白序列（帶有跨膜區(qū)）；pcDNA3.1質(zhì)粒用于模擬轉(zhuǎn)染對照。藍色熒光蛋白（BFP）和紅色熒光蛋白編碼質(zhì)粒（dsRed）用作轉(zhuǎn)染的293T細胞的標記蛋白；293細胞用CoV-S和熒光蛋白（BFP）瞬轉(zhuǎn)后作為工具細胞，將pcDNA3.1和15μg熒光蛋白（dsRed）瞬轉(zhuǎn)后作為內(nèi)部對照細胞。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細胞，以1-ml等分樣的形式讓細胞在? 80°C下保存。檢測前，將等分試樣的細胞解凍，重懸于FACS緩沖液中。將每個樣品（S蛋白工具細胞和模擬轉(zhuǎn)染對照細胞）中的每個樣品的0.5×10^5個細胞接種到96孔板中，加入標準品或待測樣品的梯度稀釋液，4°C孵育30 min。用流式緩沖液洗滌兩次，加入流式二抗染色（30分鐘，4°C，抗IgG-AF647；抗IgM-BV711）。PBS洗滌兩次，然后重懸于流式緩沖液中以進行流式細胞術(shù)分析。

圖4流式檢測血樣的新冠抗體

將表達SARS-CoV-2S蛋白的293T細胞和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的細胞（模擬物）與COVID-19患者血清（S1-S3）或陰性對照血清（S4–S6）一起孵育）。左圖顯示了將共轉(zhuǎn)染的熒光蛋白作為轉(zhuǎn)染標記（BFP和dsRed）的細胞群的畫門。右邊的直方圖分別描繪了兩個細胞群在每個樣品中的IgM和IgG熒光信號。

圖5 通過ACE-2-Fc標準品對樣本中的SARS-CoV-2抗體進行流式定量檢測

（A）用ACE-2-Fc標準品做流式檢測，用來確定標準血清的ACE2濃度。

（B）用流式細胞術(shù)檢測標準血清。曲線擬合生成用于未知樣品絕對定量的標準曲線。

（C）EuroImmun ELISA檢測標準血清。曲線擬合生成用于未知樣品絕對定量的標準曲線。

（D）通過ELISA和SARS-CoV-2特異性IgG的細胞流式檢測，對7份COVID-19患者血樣的新冠抗體進行定量。

總結(jié)一下，抑制細胞融合法需要準備編碼抗原和配體的2種工具細胞株、中和抗體標準品和β半乳糖苷酶試劑盒。流式法只需要準備表達病毒抗原的1種工具細胞株、檢測IgG或IgM的流式二抗、中和抗體標準品即可開展實驗，而且流式可以圈出目標細胞繼續(xù)后續(xù)定量分析，因此比抑制細胞融合實驗的精確度更高。

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