一、前言

分子+疾病+調(diào)控，是我們科研的慣用套路，如何在這個(gè)框架下產(chǎn)出精彩的故事和高分文章呢？今日我們以這篇文章為例：胰島素樣生長(zhǎng)因子2 （IGF2）通過細(xì)胞外處理蛋白質(zhì)聚集物來預(yù)防亨廷頓病【Insulinlike growth factor 2 （IGF2） protects against Huntington’s disease through the extracellular disposal of protein aggregates; 2020; IF=14.251】。

二、文章速讀

受損的神經(jīng)元蛋白平衡是許多神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)顯著特征，突出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）功能的改變。之前報(bào)道過靶向轉(zhuǎn)錄因子XBP1是ER應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，可延緩疾病的進(jìn)展，減少各種神經(jīng)變性模型中的蛋白質(zhì)聚集。為了確定在XBP1缺失下可能解釋神經(jīng)保護(hù)作用的疾病修飾基因，文章對(duì)這些動(dòng)物的大腦皮層和紋狀體進(jìn)行了基因表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子2 （Igf2）是主要的上調(diào)基因。文章研究了IGF2信號(hào)在亨廷頓?。℉D）模型中對(duì)蛋白質(zhì)聚集的影響作為證明。細(xì)胞培養(yǎng)研究顯示，IGF2處理降低了突變體亨廷頓蛋白和聚谷氨酰胺肽的細(xì)胞內(nèi)聚集物的負(fù)荷。這些結(jié)果在HD患者和脊髓小腦失調(diào)患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）培養(yǎng)基棘神經(jīng)元中得到驗(yàn)證。突變亨廷頓蛋白水平的降低與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)半衰期的降低有關(guān)。IGF2引發(fā)的異常蛋白聚集水平下降與自噬活性和蛋白酶體途徑無關(guān)，而這兩種途徑是清除突變體亨廷頓蛋白的主要途徑。相反，IGF2信號(hào)通過外泌體和微泡促進(jìn)可溶性突變亨廷頓蛋白的分泌，涉及肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的改變。用基因療法將IGF2注入HD小鼠大腦，在三種不同的動(dòng)物模型中，突變體亨廷頓蛋白的水平顯著下降。此外，對(duì)HD患者死后腦組織和血液樣本的分析顯示IGF2水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)IGF2是HD中解除管制的相關(guān)因子，作為一種抑制異常蛋白種類積累的疾病調(diào)節(jié)劑。

三、文章背景

? 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集是多種神經(jīng)退行性疾病的先兆，如HD。分子伴侶常駐于胞液和ER以確保新合成的蛋白精確折疊。質(zhì)控機(jī)制通過蛋白酶體、溶酶體、自噬途徑去除錯(cuò)誤折疊的蛋白。隨著年齡的增長(zhǎng)，蛋白酶體網(wǎng)絡(luò)的容量減少，可能會(huì)增加蛋白聚集和神經(jīng)退化。神經(jīng)退行性疾病中蛋白質(zhì)穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)改變的主要節(jié)點(diǎn)之一涉及ER，是細(xì)胞中蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制的主要部位。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)了一種快速而協(xié)調(diào)的信號(hào)通路，即未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），以加強(qiáng)適應(yīng)性程序并恢復(fù)蛋白穩(wěn)定。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不可修復(fù)的應(yīng)激通過細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

? UPR由激活的特殊應(yīng)激轉(zhuǎn)導(dǎo)子啟動(dòng)，強(qiáng)調(diào)肌醇需要的跨膜激酶/內(nèi)切酶（IRE1α）是最保守的信號(hào)分支。IRE1亞型是一種位于ER的激酶和核糖核酸內(nèi)切酶，在激活時(shí)，它控制編碼X-box結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA的加工，導(dǎo)致表達(dá)穩(wěn)定和活性，轉(zhuǎn)錄因子稱為XBP1s。XBP1s上調(diào)蛋白折疊相關(guān)基因、質(zhì)控、ER易位和ERAD。在秀麗隱桿線蟲中，神經(jīng)元中XBP1的表達(dá)控制著機(jī)體的衰老，這可能與調(diào)節(jié)正常衰老的經(jīng)典信號(hào)通路包括胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）-1和FOXO （DAF16）通路相互干擾。作者此前觀察到在HD模型大腦發(fā)育過程中遺傳阻斷IRE1α/XBP1通路可導(dǎo)致神經(jīng)保護(hù)，可以用減少異常蛋白聚集物積累的激元適應(yīng)變化來解釋。這些結(jié)果說明了XBP1和UPR在神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展中的更廣泛的意義，強(qiáng)調(diào)了確定介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制的必要性。

四、方法技術(shù)

1. XBP1基因敲除鼠

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腦皮層和紋狀體進(jìn)行微陣列（SAM）分析

3. qRT-PCR

4. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

5. 自噬、蛋白酶體檢測(cè)

6. Western Blot

7. 脈沖追逐實(shí)驗(yàn)

8. mHtt分泌與點(diǎn)位印跡檢測(cè)

9. 囊泡分離和納米粒子跟蹤分析

10.定量蛋白質(zhì)組學(xué)

11.Rac1 pull-down和肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)

12.腺病毒載體構(gòu)建及體內(nèi)外感染

13.模型小鼠旋轉(zhuǎn)測(cè)試

14.組織免疫熒光

15.切片顯微定量

16.HD患者血清ELISA

17.神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）誘導(dǎo)分化中型多脊神經(jīng)元（MSN）

18.脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3類（SCA-3）患者真皮成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）生成

19.IPSC衍生神經(jīng)元生成

20.神經(jīng)元興奮性刺激

21.免疫組化

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.Igf2在XBP1敲除的小鼠腦內(nèi)上調(diào)

? 獲取XBP1敲除小鼠大腦皮層和紋狀體進(jìn)行基因表達(dá)分析，得到差異表達(dá)基因，在兩個(gè)腦組織之間進(jìn)行比較，大腦皮層和紋狀體之間的基因表達(dá)變化沒有重疊，只有Igf2的表達(dá)在兩個(gè)腦區(qū)被改變，在XBP1cKO小鼠中表達(dá)更高。

? 獨(dú)創(chuàng)性通路分析（IPA）提示Igf2與與Htt相關(guān)的神經(jīng)功能障礙相關(guān)的關(guān)鍵生物學(xué)通路與淀粉樣前體蛋白之間存在關(guān)系。第二次IPA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Htt是幾個(gè)靶基因（Igf2、Gfap、Mmp14、Mpeg1和Serpine3）失鏈且p值最低的上游調(diào)控因子的候選基因。

? real-time PCR驗(yàn)證了XBP1cKO小鼠大腦中Igf2表達(dá)水平的變化，并檢測(cè)到與野生型同窩小鼠相比Igf2有顯著增加。

2.IGF2減少polyQ和mHtt聚集

? 為確定IGF2表達(dá)對(duì)異常蛋白積累的影響，將polyQ79-EGFP表達(dá)載體與IGF2或空載體（Mock）一起轉(zhuǎn)染Neuro2a細(xì)胞，分析細(xì)胞內(nèi)包涵體。發(fā)現(xiàn)當(dāng)與IGF2載體共轉(zhuǎn)染時(shí)，polyQ79-EGFP包涵體的數(shù)量顯著減少。

? 為了評(píng)估對(duì)聚集的影響是否針對(duì)IGF2，測(cè)量共轉(zhuǎn)染IGF1表達(dá)載體的細(xì)胞中polyQ79-EGFP的積累。通過一系列的實(shí)驗(yàn)說明IGF2的表達(dá)降低了polyQ79聚集物和HMW物種的水平。

? 為了確定IGF2是否在細(xì)胞外細(xì)胞室發(fā)揮作用，用富含IGF2的條件培養(yǎng)基處理表達(dá)polyQ79-EGFP的細(xì)胞。還包括了一個(gè)表達(dá)突變亨廷頓蛋白跨越外顯子1的片段，有85個(gè)CAG重復(fù)的構(gòu)建（GFP-mHttQ85），由IGF2或空載體轉(zhuǎn)染Neuro2a細(xì)胞24 h生成的IGF2富集培養(yǎng)基預(yù)處理的神經(jīng)2a細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)polyQ79-EGFP或GFP-mHttQ85。IGF2富集處理的細(xì)胞觀察到明顯減少蛋白質(zhì)聚合和夾雜物。表明IGF2可能發(fā)揮其功能以旁分泌的方式，可能通過與膜受體結(jié)合激活信號(hào)通路。此外，用胰島素處理細(xì)胞并沒有降低polyQ79-EGFP HMW物種的水平，與IGF1過表達(dá)的結(jié)果相似。

? 為了評(píng)估IGF2是否可以降低預(yù)形成聚合物的含量，表達(dá)polyQ79-EGFP或GFP-mHttQ85 24小時(shí)，然后用IGF2富集或?qū)φ张囵B(yǎng)基處理Neuro2a細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞暴露于IGF2條件下的培養(yǎng)基可減弱錯(cuò)誤折疊polyQ79-EGFP或GFP-mHttQ85物種的負(fù)載，這表明IGF2可能會(huì)觸發(fā)異常錯(cuò)誤折疊蛋白的降解或分解。

3.IGF2減少了膨脹的聚谷氨酰胺蛋白的聚集

? 為了確定IGF2表達(dá)對(duì)表達(dá)全長(zhǎng)度mHtt的細(xì)胞模型的影響，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞與表達(dá)載體的myc標(biāo)記版本的全長(zhǎng)mHtt重復(fù)103谷氨酰胺（FL HttQ103-myc）連同IGF2或空載體（Mock）。通過western blot分析觀察到IGF2的表達(dá)導(dǎo)致FL HttQ103-myc的單體不溶性物種和洗滌不溶性物種的水平顯著降低。用dot - blot方法分析細(xì)胞裂解液時(shí)，也證實(shí)了上述結(jié)果。總的來說，IGF2的表達(dá)導(dǎo)致全長(zhǎng)mHtt的單體和HMW形式的水平下降。

? 為了確定了IGF2在不依賴于過度表達(dá)的人類HD模型中可能的影響，該模型使用了來自患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）。因此，使用來自HD患者和對(duì)照組的iPSC生成了人中棘神經(jīng)元（MSNs）。為了表達(dá)IGF2，使用2型血清將其cDNA包裝到腺相關(guān)病毒載體（AAV）中，該載體對(duì)神經(jīng)元具有高度的趨向性。用AAV-IGF2或AAV-Mock轉(zhuǎn)染單分散微球培養(yǎng)17天，western blot檢測(cè)mHtt水平。值得注意的是，IGF2的表達(dá)導(dǎo)致了HD衍生的MSNs中mHtt總水平的下降。對(duì)照組的單分散二氧化硅微球培養(yǎng)物并沒有改變野生型Htt的水平。

? 為了驗(yàn)證IGF2表達(dá)對(duì)其他疾病相關(guān)基因水平的可能影響，我們使用從SCA3患者獲得的iPSC生成神經(jīng)元培養(yǎng)物，并將其暴露于IGF2富集的條件細(xì)胞培養(yǎng)液中。細(xì)胞暴露于谷氨酸導(dǎo)致突變體Ataxin-3的異常聚集，在洗脫劑不溶性部分中通過突變蛋白的積累來反映。將細(xì)胞暴露在富含igf2的培養(yǎng)基中會(huì)導(dǎo)致突變體Ataxin-3聚集物的水平降低。因此，IGF2在減少含聚谷氨酰胺蛋白的異常聚集方面具有更廣泛的作用。

4.IGF2降低細(xì)胞內(nèi)可溶性mHtt的半衰期

細(xì)胞暴露于IGF2誘導(dǎo)的mHtt聚集穩(wěn)態(tài)水平的降低可能是合成速率的衰減或降解的增加。在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，將mHttQ43-GFP構(gòu)建物與IGF2或空載體（Mock）共轉(zhuǎn)染。為了評(píng)估轉(zhuǎn)譯率，在總周期60分鐘內(nèi)，以S35標(biāo)記的甲硫氨酸和半胱氨酸的脈沖增加間隔。這些實(shí)驗(yàn)表明，在表達(dá)或不表達(dá)IGF2的細(xì)胞中，mHtt的生物合成是相同的。此外，一般蛋白的合成不受IGF2表達(dá)的影響。然后，用脈沖追逐法監(jiān)測(cè)細(xì)胞提取物中mHttQ43-GFP水平的衰減，以消除其半衰期。IGF2的表達(dá)顯著降低了細(xì)胞提取物中mHttQ43-GFP的半衰期，但不影響蛋白質(zhì)組的整體穩(wěn)定性。在這些實(shí)驗(yàn)中，沒有觀察到mHttQ43的HMW物種的存在，這表明IGF2正在影響可溶性或單體形式的穩(wěn)定性。總之，IGF2信號(hào)降低了總mHtt的含量，并縮短了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的半衰期。

5.自噬和蛋白酶體途徑不參與IGF2誘導(dǎo)的polyQ聚集物的減少

? HEK293T細(xì)胞與mHttQ43-GFP和IGF2表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用放射性脈沖在抑制劑存在的情況下進(jìn)行追趕實(shí)驗(yàn)。氯喹和硼替佐米都沒有恢復(fù)IGF2對(duì)mHtt穩(wěn)定性的影響。

? 在基礎(chǔ)條件下，蛋白酶體抑制劑或MG132處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)包涵體數(shù)量略有增加，但在抑制劑存在的情況下，IGF2表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的polyQ79-EGFP包涵體數(shù)量沒有變化通過western blot和flter trap分析，分別測(cè)量了polyQ79-EGFP HMW的種類和聚集物，從而驗(yàn)證了這些在Neuro2a細(xì)胞中的觀察結(jié)果。在IGF2處理的細(xì)胞中，抑制蛋白酶體后polyQ HMW物種形成的基礎(chǔ)增加消失了。這些結(jié)果表明IGF2信號(hào)可能會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)聚合/可溶形式的polyQ的比例，或者它可能會(huì)改變異常polyQ物種的方向，以介導(dǎo)其清除。

? 在神經(jīng)元自噬上調(diào)的情況下，我們?cè)u(píng)估過表達(dá)IGF2的細(xì)胞的自噬激活。在有無polyQ79-EGFP表達(dá)載體的情況下，用IGF2轉(zhuǎn)染Neuro2a細(xì)胞。然后用氯喹抑制溶酶體活性后監(jiān)測(cè)自噬，分析LC3和p62水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF2不刺激Neuro2a細(xì)胞自噬，但略有減少LC3-II的積累。同樣，用氯喹處理細(xì)胞也不能恢復(fù)蛋白質(zhì)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，IGF2處理誘導(dǎo)的polyQ79-EGFP聚集量的減少與蛋白酶體和自噬/溶酶體途徑無關(guān)。IGF2可能降低可溶性和單體形式的mHtt或polyQ的水平，降低它們的聚集水平，通過轉(zhuǎn)移細(xì)胞內(nèi)的平衡向非聚集形式。另外，IGF2信號(hào)通路可能會(huì)使異常蛋白種類的清除轉(zhuǎn)向一種獨(dú)立于蛋白酶體和大自噬/溶酶體活性的替代途徑。

6.IGF2信號(hào)通過細(xì)胞外小泡觸發(fā)polyQ分泌

? 使用dot blot方法分析培養(yǎng)基時(shí)，IGF2表達(dá)的細(xì)胞中polyQ79-EGFP的分泌增強(qiáng)。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中SOD1G85R水平的分析顯示，IGF2可誘導(dǎo)其分泌，而胞質(zhì)標(biāo)記物如微管蛋白未見變化，表明細(xì)胞未裂解或胞質(zhì)泄漏。盡管信號(hào)很低，使用flter trap檢測(cè)到細(xì)胞外基礎(chǔ)水平存在大的polyQ79-EGFP聚集物，這一現(xiàn)象在表達(dá)IGF2的細(xì)胞中增加了兩倍。

? 使用siRNAs來干擾胰島素和IGF1受體(InsR和IGF1R阻斷抗體靶向IGF2受體(IGF2R)，拮抗IGF2R幾乎降低了聚Q79-EGFP分泌水平的一半，而INSR或IGF1R的敲除則降低了一半。這些結(jié)果表明，IGF2信號(hào)通過IGF2R的參與降低了聚Q79-EGFP在細(xì)胞中的負(fù)載，導(dǎo)致了polyQ蛋白細(xì)胞外處理。

7. IGF2通過外顯子和微囊泡刺激聚Q分泌

? 用BrefeldinA阻斷ER至高爾基體，不能抑制IGF2刺激細(xì)胞中聚Q79-EGFP的分泌。然后探索細(xì)胞外小泡中聚Q79-EGFP的存在，使用納米粒子跟蹤分析系統(tǒng)來確定囊泡在細(xì)胞培養(yǎng)基中的大小分布和濃度表達(dá)IGF2的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IGF2表達(dá)細(xì)胞中囊泡的釋放增強(qiáng)，平均直徑在30~150 nm之間，而一小部分（

? 通過順序離心分離微囊和外胚層富集組分。在表達(dá)IGF2的細(xì)胞中，在這兩個(gè)組分中檢測(cè)到聚Q79-EGFP水平的增加。聚Q79-EGFP的主要單體和可溶性形式被分泌到微泡和外泌體，沒有洗滌劑不溶性HMW物種。因此，IGF2信號(hào)通過外顯子和微囊泡促進(jìn)聚Q79-EGFP的分泌，降低細(xì)胞內(nèi)聚Q79-EGFP的水平。

8.細(xì)胞骨架重構(gòu)有助于IGF2誘導(dǎo)的polyQ分泌

? 為了表征IGF2刺激下的蛋白質(zhì)組重構(gòu)，我們應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)記-多維蛋白識(shí)別技術(shù)(MuDP IT)定量蛋白質(zhì)組學(xué)。鑒定了總共199個(gè)蛋白質(zhì)，它們的表達(dá)水平發(fā)生了變化，p值0.1倍的變化。IGF2的表達(dá)不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)組學(xué)的改變。然而，功能富集分析表明，IGF2的表達(dá)觸發(fā)了與大分子復(fù)合物相關(guān)的蛋白質(zhì)的波動(dòng)、拆卸、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞骨架重組。由IGF2修飾的一組蛋白質(zhì)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和調(diào)控有關(guān)，包括幾個(gè)肌動(dòng)蛋白 結(jié)合蛋白、RhoGTPase、波形蛋白、動(dòng)力蛋白激活蛋白和動(dòng)力蛋白等因素。

? 由于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分泌和囊泡貿(mào)易的關(guān)鍵，探討IGF2是否對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)有任何影響，結(jié)果顯示IGF2處理在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生了非?？斓募?dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞形態(tài)的變化， 在細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)肌動(dòng)蛋白簇和flopodia的發(fā)育增加。這些結(jié)果是通過可視化肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在小鼠胚胎胚胎纖維細(xì)胞中融合的。

? 考慮到RAC1在細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)中的中心作用，評(píng)估了IGF2刺激下的RAC活性。結(jié)果表明，與GTP偶聯(lián)的活性Rac1的量迅速增加，治療IGF2。

? 測(cè)試肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)對(duì)聚Q79-EGFP肽釋放到細(xì)胞外空間的功能貢獻(xiàn)。神經(jīng)2a細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染兩個(gè)顯性陰性 (Rac117N)和Rac1的本構(gòu)活性(Rac1V12)形式。Rac117N能夠阻斷IGF2增強(qiáng)的聚Q79-EGFP分泌。相反，Rac1V12的表達(dá)促進(jìn)了在基礎(chǔ)水平上分泌OlyQ79-EGFP，而在IGF2刺激的細(xì)胞中沒有觀察到差異，提示該途徑已經(jīng)完全激活。用NSC23766抑制RAC1-GTPase活性，顯著降低聚Q79-EGFP的分泌。這些效應(yīng)與在NSC23766存在下用IGF2處理的細(xì)胞內(nèi)聚Q79-EGFP的細(xì)胞內(nèi)HMW物種水平的增加平行。這些結(jié)果提示IGF2信號(hào)觸發(fā)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的快速變化，導(dǎo)致聚Q79-EGFP肽進(jìn)入細(xì)胞外空間。

9.體內(nèi)IGF2減少M(fèi)Htt聚集

? 為了確定IGF2在體內(nèi)對(duì)mHtt聚集水平的可能影響，進(jìn)行了單側(cè)立體定向注射AAVS混合物，以交付Htt588Q95-RFP與IGF2或空矢量(Mock)進(jìn)入紋狀體。在AAV分娩后兩周，對(duì)小鼠進(jìn)行安樂死，并解剖紋狀體進(jìn)行生化分析。在成年小鼠中，IGF2的局部表達(dá)導(dǎo)致mHtt聚集明顯減少。與細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)一致，注射AAV-IGF2的HD小鼠的大腦中也減少了mHtt的單體形式。為了評(píng)估過度表達(dá)IGF2對(duì)神經(jīng)元存活的影響，測(cè)量了DARPP-32水平，作為中等刺狀神經(jīng)元活力的標(biāo)志。與對(duì)照病毒相比AAV-IGF2處理的動(dòng)物中檢測(cè)到DARPP-32明顯更高的水平。

? 考慮到使用病毒HD模型獲得的陽性結(jié)果，隨后評(píng)估了基因治療策略，在雜合狀態(tài)下在YAC128轉(zhuǎn)基因模型中提供IGF2。進(jìn)行了雙側(cè)立體定向注射將AAV-IGF2或空載體導(dǎo)入3個(gè)月大的YAC128小鼠紋狀體，然后在四周后對(duì)腦提取物進(jìn)行生化分析，發(fā)現(xiàn)紋狀體中全長(zhǎng)mHtt表達(dá)減少，平均下降近80%。注射出生后第1天或第2天(P1-P2)YAC128小鼠的DAV-IGF2或?qū)φ蛰d體，并在3個(gè)月后解剖紋狀體。免疫印跡分析表明IGF2的表達(dá)顯著降低了YAC128動(dòng)物大腦中mHtt的總水平。最后，確定了使用基于IGF2的基因治療對(duì)實(shí)驗(yàn)性HD臨床進(jìn)展的功能后果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，IGF2進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)改善了HD轉(zhuǎn)基因小鼠的平均運(yùn)動(dòng)性能。

? 為了補(bǔ)充我們的體內(nèi)驗(yàn)證，用第三個(gè)模型，R6/2小鼠，一個(gè)轉(zhuǎn)基因HD模型，表達(dá)了人類Huntingtin的第1外顯子，含有~150個(gè)CAG重復(fù)，這是ALLO 胞內(nèi)m Htt包裹體的可視化。評(píng)估了IGF2在R6/2小鼠大腦中的作用，在AAVIGF2給藥時(shí)，觀察到mHtt陽性夾雜物含量的強(qiáng)烈降低， 這些實(shí)驗(yàn)的量化表明，用AAV-IGF2處理的R6/2小鼠的大腦中有近60%的顯著減少。綜上所述，這些結(jié)果表明，人工執(zhí)行IGF2在大腦中的表達(dá)減少了不同HD模型中異常的蛋白質(zhì)聚集。

10. HD患者紋狀體和血樣中IGF2水平降低

? 進(jìn)一步探討HD患者標(biāo)本中IGF2表達(dá)的可能改變。Western blot分析結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，顯示HD患者大腦中平均IGF2水平降低了近66%。

? 考慮到HD死后腦組織中IGF2水平的意外下降，評(píng)估了HD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中IGF2的存在。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HD衍生細(xì)胞IGF2水平降低，用western blot分析顯示其蛋白水平下降了近80%；而其mRNA水平下降了近90%。綜上所述，這些結(jié)果表明HD患者的腦和血細(xì)胞中IGF2水平急劇降低。

六、思路總結(jié)

? 選定一個(gè)分子X

? 確定其作用的疾病A（潛在的治療作用）?

? 選擇X可能通過機(jī)制M作用于A

? 動(dòng)物模型證明X表達(dá)變化（動(dòng)物疾病模型、基因敲除模型）

? 體外模型論證X的M機(jī)制（選擇M可量化及可觀察的指標(biāo)）

? A樣本中X水平與對(duì)照組不同

科研套路深入分析及實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，

廣州輝園苑為您保駕護(hù)航，

讓思路更清晰、科研更順利！

一站式整體科研服務(wù)平臺(tái)

做最真實(shí)的數(shù)據(jù)，提供最真誠(chéng)的服務(wù)

如有需要，歡迎聯(lián)系我們：

020-29039963/qq:2951428216