一、研究背景

乳腺癌仍然是全世界婦女面臨的一個(gè)嚴(yán)重威脅。據(jù)估計(jì)，2018年乳腺癌新增病例超過(guò)210萬(wàn)，導(dǎo)致62.7萬(wàn)女性死亡。乳腺癌的死亡率主要是由于化療耐受和轉(zhuǎn)移。給予新的靶向干預(yù)可能有助于預(yù)防腫瘤發(fā)生或侵襲性轉(zhuǎn)移，從而提高晚期乳腺腫瘤患者的生存率和臨床預(yù)后。雖然乳腺癌的全球基因表達(dá)模式已被廣泛研究，但涉及晚期乳腺腫瘤的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控尚未被充分研究。

?

目前已有100多種RNA修飾的報(bào)道，其中N6-methyladenosine (m6A)修飾，是真核mRNAs中最常見(jiàn)的內(nèi)修飾。這種修飾的失調(diào)與人類疾病，包括惡性腫瘤密切相關(guān)。并且m6A的修飾是動(dòng)態(tài)可逆的，在哺乳動(dòng)物中，RNA既可以在甲基化轉(zhuǎn)移酶（METTL3、METTL14、WTAP）的作用下發(fā)生m6A甲基化修飾，又可以在FTO、ALKBH5等酶的作用下發(fā)生去甲基化修飾。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，m6A是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后修飾，調(diào)控mRNA和非編碼RNA的多種生物學(xué)過(guò)程，如調(diào)節(jié)前體mRNA的成熟、翻譯和降解。

二、研究結(jié)果

? RNA去甲基化酶FTO，在人類乳腺癌中表達(dá)上調(diào)

作者首先分析了分析了111例乳腺腫瘤和12例非腫瘤性乳房組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，F(xiàn)TO在乳腺腫瘤中顯著上調(diào)；同時(shí)，在乳腺癌三個(gè)臨床階段的DNBC組(ER?/PR?/Her2+)和晚期組(二級(jí)和三級(jí))中，也發(fā)現(xiàn)FTO的上調(diào)；隨后作者進(jìn)一步在乳腺癌細(xì)胞系和組織中驗(yàn)證了RNA m6A的水平，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺腫瘤中，m6A的豐度明顯下降。通過(guò)臨床結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)FTO的上調(diào)與晚期乳腺癌患者和ER陰性乳腺癌患者的低生存率顯著相關(guān)。這些結(jié)果提示FTO的上調(diào)可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

? FTO顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、集落形成，減少細(xì)胞凋亡

接下來(lái)，為了確定FTO是否對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，作者在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定敲降FTO，隨后進(jìn)行了一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO敲降后，細(xì)胞增殖和集落形成能力被抑制，細(xì)胞凋亡水平上升；同時(shí)，Mammosphere formation assay結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲降FTO后，乳腺癌細(xì)胞成球能力下降。

綜上所述，研究結(jié)果表明FTO在控制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、集落形成和細(xì)胞死亡方面起著重要的作用。

? 沉默F(xiàn)TO可抑制裸鼠乳腺腫瘤生長(zhǎng)

接下來(lái)，作者進(jìn)一步探究FTO在體內(nèi)的作用。首先在4T1細(xì)胞（小鼠來(lái)源的乳腺癌細(xì)胞系）中構(gòu)建了FTO敲降穩(wěn)定細(xì)胞株，然后構(gòu)建了皮下荷瘤模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)TO敲降的皮下腫瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制，同時(shí)，Rhein（FTO抑制劑）實(shí)驗(yàn)組小鼠也觀察到腫瘤被抑制生長(zhǎng)；隨后，作者進(jìn)一步在NOD/SCID小鼠中進(jìn)行了原位異種移植實(shí)驗(yàn)，并且穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶用于活體成像，相比于對(duì)照組，F(xiàn)TO敲除組的小鼠幾乎沒(méi)有檢測(cè)到腫瘤。

此外，通過(guò)尾靜脈注射FTO敲降4T1細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，建立肺轉(zhuǎn)移瘤模型。結(jié)果顯示，在FTO敲降組中，肺轉(zhuǎn)移明顯被抑制。以上結(jié)果表明FTO在體內(nèi)促進(jìn)乳腺腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。

? RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)BNIP3是FTO介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶點(diǎn)

為了探討FTO的分子機(jī)制及其在乳腺癌中的下游靶點(diǎn)，作者用FTO敲降的細(xì)胞株MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞（FTO抑制劑DMOG處理）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，GEO2R分析發(fā)現(xiàn)，在這兩個(gè)樣本中有55個(gè)具有顯著變化的基因重疊；KEGG進(jìn)一步分析顯示，抑制FTO影響的差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡信號(hào)通路。作者進(jìn)一步采用m6A-Seq來(lái)繪制MDA-MB-231細(xì)胞中m6A修飾圖譜，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)m6A信號(hào)在mRNAs的終止密碼子附近富集。隨后，作者在其中選擇FoxO信號(hào)通路中的促凋亡基因BNIP3作為FTO介導(dǎo)的m6A修飾的候選靶點(diǎn)進(jìn)行下一步研究；BNIP3在FTO敲降和FTO抑制的細(xì)胞株中都顯著上調(diào)，且string共表達(dá)分析表明，BNIP3與凋亡基因如Bcl-2和Caspase3密切相關(guān)。

? FTO-m6A依賴機(jī)制對(duì)BNIP3的表觀遺傳學(xué)沉默

為了驗(yàn)證BNIP3是FTO的下游靶點(diǎn)，作者檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞中BNIP3 mRNA的表達(dá)水平和蛋白的表達(dá)水平。與RNA-seq數(shù)據(jù)一致，BNIP3在FTO敲降細(xì)胞株MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中顯著上調(diào)，并且降低細(xì)胞中Bcl2的表達(dá)，促進(jìn)了Caspase 3的裂解。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TO通過(guò)下調(diào)BNIP3來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。接下來(lái)，作者進(jìn)一步確認(rèn)BNIP3是FTO-m6A修飾的靶標(biāo)，m6A MeRIP分析發(fā)現(xiàn)，敲降FTO顯著提高了BNIP3基因的m6A水平。前面的m6A RNA-seq發(fā)現(xiàn)，在靠近BNIP3終止密碼子的3′UTR中鑒定出3個(gè)潛在的m6A修飾位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，位點(diǎn)#1是FTO對(duì)BNIP3 m6A調(diào)控的修飾位點(diǎn)。

? BNIP3是一種腫瘤抑制因子，在臨床乳腺癌患者中與FTO表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

BNIP3作為FTO的功能靶點(diǎn)，是細(xì)胞凋亡所必需，提示其在乳腺癌中具有抑癌作用。通過(guò)對(duì)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，作者發(fā)現(xiàn)與非腫瘤附屬組織相比，BNIP3在包括乳腺癌在內(nèi)的各種人類癌癥中下調(diào)，且過(guò)表達(dá)BNIP3激活了Caspase3的分裂，抑制了Bcl-2的表達(dá)。對(duì)R2數(shù)據(jù)集的分析發(fā)現(xiàn)，BNIP3的水平與使用紫杉烷-蒽環(huán)類藥物和他莫昔芬治療的乳腺癌患者的總生存率呈正相關(guān)。同時(shí)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE9014)分析和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，在乳腺腫瘤中觀察到BNIP3和FTO的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，在4T1皮下乳腺癌模型中，作責(zé)檢測(cè)到BNIP3在FTO抑制或FTO沉默腫瘤樣本中上調(diào)。結(jié)論：在臨床樣本中，BNIP3與FTO表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

? 沉默BNIP3可顯著減輕體外和體內(nèi)依賴于FTO的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移抑制

為了探究BNIP3是否介導(dǎo)FTO依賴性腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展，作者在FTO穩(wěn)定敲除乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染靶向BNIP3的shRNAs，發(fā)現(xiàn)抑制BNIP3后減輕了由FTO介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，EDU實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了這一結(jié)論。隨后，為了驗(yàn)證BNIP3在體內(nèi)的作用，作者將FTO-knockdown 4T1和雙knockdown穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞(shFTO和shBNIP3)皮下植入Balb/c小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙重敲降(shFTO和shBNIP3)促進(jìn)了小鼠乳腺腫瘤的生長(zhǎng)。此外，在肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，雙敲除的4T1細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移增加。結(jié)論：沉默BNIP3可以顯著減輕FTO依賴的體內(nèi)外腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移抑制作用。

總結(jié)

m6A去甲基酶FTO在乳腺癌中的扮演著致癌角色。在FTO低表達(dá)細(xì)胞中，BNIP3 mRNA的3'UTR被m6A甲基化，BNIP3的表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)凋亡。而在FTO高表達(dá)細(xì)胞中，F(xiàn)TO介導(dǎo)BNIP3的m6A去甲基化，導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，F(xiàn)TO-m6A-BNIP3信號(hào)通路可能成為乳腺癌治療的潛在治療靶標(biāo)。