一、背景

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是來(lái)源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，同時(shí)還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)能力。由于這些特點(diǎn)，間充質(zhì)干細(xì)胞被廣泛用于細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)的研究。

間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛，除了最初的發(fā)現(xiàn)骨髓以外，人們陸續(xù)從臍帶、臍帶血、脂肪、牙髓、羊水、羊膜、胎盤(pán)等組織分離出MSCs，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，相比間充質(zhì)干細(xì)胞的傳統(tǒng)來(lái)源骨髓而言，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便，無(wú)創(chuàng)，含量豐富，易于分離培養(yǎng)，體外擴(kuò)增迅速且生物性能穩(wěn)定，免疫原性較低且更為原始等特點(diǎn)，被認(rèn)為是替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想來(lái)源，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

二、常見(jiàn)分離方法

目前所使用的hUCMSCs分離培養(yǎng)方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法兩種，也有研宄者綜合使用這兩種方法。酶消化法常使用膠原酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶中的一種或幾種處理剪碎的臍帶組織，在短時(shí)間內(nèi)可以獲得hUCMSCs，但大量研究發(fā)現(xiàn)，組織塊貼壁法雖然花費(fèi)時(shí)間更多，但所得到的hUCMSCs質(zhì)量遠(yuǎn)比酶消化法高很多，因此本文將向大家介紹用組織貼壁法進(jìn)行hUCMSCs的原代分離。

三、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

正常足月分娩的健康嬰兒臍帶組織、手術(shù)器械、培養(yǎng)瓶/皿、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 ug/mL、MSC nutriStem? XF Basal Mediun（BI）、MSC nutriStem? XF supplement(BI)、干細(xì)胞溫和消化酶、超凈工作臺(tái)、磷酸緩沖液、37℃、5%CO2飽和90%濕度的培養(yǎng)箱等。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、取新生兒臍帶，在超凈工作臺(tái)中用鑷子將臍帶放入50ml離心管中，2%青鏈霉素混合液的 PBS 緩沖液，震蕩離心管，重復(fù)清洗三遍，盡量棄除殘留的血液；

2、將臍帶完全浸入75%酒精溶液中消毒，并迅速取出，加入2%青鏈霉素混合液的 PBS 緩沖液清洗三遍，棄除殘留的乙醇；

3、將臍帶轉(zhuǎn)移至 15cm 培養(yǎng)皿中，用手術(shù)到將臍帶組織剪成3-5cm大小的小段（圖1），剝離臍帶中的臍靜脈和臍動(dòng)脈（如圖2）；反復(fù)用含 2%青鏈霉素混合液的 PBS 緩沖液漂洗臍帶，直至漂洗液中無(wú)血水；

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圖1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖2

4、持續(xù)觀察，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%即可進(jìn)行傳代，用組織貼壁法分離細(xì)胞，一般在一周左右可以觀察到細(xì)胞爬出來(lái)，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%通常需要兩周以上，細(xì)胞爬出來(lái)的快慢與臍帶的質(zhì)量也有一定的關(guān)系；

5、細(xì)胞培養(yǎng)：本培養(yǎng)基配方為無(wú)血清體系，因此在傳代時(shí)不能用胰酶，需要用到溫和的消化酶，取匯合度達(dá)到80%以上的細(xì)胞，吸棄原培養(yǎng)基，加入PBS清洗兩遍，吸棄PBS加入1mL的溫和消化酶，在鏡下觀察大部分細(xì)胞回縮、變圓甚至漂起，時(shí)間大約2min，加入5倍胰酶體積的PBS將細(xì)胞吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)移至離心管中1000rpm離心5min，棄上清后加入PBS離心洗一遍，加入培養(yǎng)基吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，按照1：2-1：4進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

小貼士

在使用組織塊貼壁法做動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)，有兩個(gè)比較關(guān)鍵的條件限制： ①組織塊具有足夠多的鋒利切口；②組織塊緊貼塑料培養(yǎng)皿底部。只有同時(shí)滿(mǎn)足以上兩點(diǎn)，才會(huì)有細(xì)胞從貼壁的組織塊周?chē)L(zhǎng)出。所以，使用該種方法進(jìn)行組織塊貼壁時(shí)，首先要將組織剪碎成細(xì)小的肉糜狀，以形成大量的鋒利切口，然后接種至培養(yǎng)皿底部進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離后第五天觀察到少量細(xì)胞從組織中爬出

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分離后第十五天細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上（左：40X、中100X、右200X）