小細胞肺癌（SCLC）占肺癌的15-20％，由于其早期即可發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移，被公認是肺癌中分化程度最低、惡性程度最高的一種亞型。這也是SCLC患者預(yù)后差、死亡率高的主要原因。因此，揭示SCLC轉(zhuǎn)移的分子機制是當前國際肺癌研究領(lǐng)域的熱點之一。來自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所的季紅斌與高大明研究組合作在The Journal of Clinical Investigation雜志上發(fā)表文章，報道發(fā)現(xiàn)CUL5/SOCS3復(fù)合物在SCLC轉(zhuǎn)移中的重要調(diào)控作用，并提示靶向SRC可作為治療CUL5缺失的SCLC的潛在策略。

圖1體內(nèi)genome-scale CRISPR/Cas9篩選SCLC轉(zhuǎn)移抑制基因

使用CRISPR/Cas9全基因組文庫結(jié)合 Rb1fl/fl Trp53fl/fl SCLC鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移模型（Rb1fl/fl Trp53fl/fl? 是SCLC臨床上常見的2個突變失活基因）篩選SCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。皮下接種文庫細胞7weeks，sgCtrl對照組無器官轉(zhuǎn)移，sgRNA library組轉(zhuǎn)移器官有肺、肝、胸壁、隔膜，取461個腫瘤用于高通量測序，篩選出142個候選基因可能參與SCLC轉(zhuǎn)移，其中Cullin-Ring E3泛素連接酶復(fù)合物的兩個組分CUL5和SOCS3都排名靠前，提示可能是抑制SCLC轉(zhuǎn)移的候選基因。

圖2 Cul5缺失增強小鼠SCLC轉(zhuǎn)移

眾所周知的是，Cullin-Ring E3泛素連接酶復(fù)合物的兩個組分CUL5和SOCS3通過Elongin BC連接從而促進底物降解。因此，后續(xù)選擇CUL5/SOCS3繼續(xù)研究。研究表明，CUL5敲除后轉(zhuǎn)移器官有肺(5/5)、肝(1/5)，胸壁(1/5)，SOCS3敲除后轉(zhuǎn)移器官有肺(5/5)、淋巴(1/5)，對照組均無轉(zhuǎn)移；值得注意的是，體內(nèi)成瘤、軟瓊脂、術(shù)后轉(zhuǎn)移小鼠、循環(huán)腫瘤細胞檢測結(jié)果顯示，敲除CUL5/SOCS3可顯著增強SCLC的增殖和轉(zhuǎn)移能力。

圖3 CUL和SOCS3缺失導(dǎo)致整合素β1累計

整合素β1是SCLC中β型整合素的主要類型，通過感知胞外基質(zhì)的信號來調(diào)控SCLC的轉(zhuǎn)移。我們推測Cullin-Ring E3泛素連接酶復(fù)合物可能調(diào)控整合素的表達。機制分析發(fā)現(xiàn)，CUL5/SOCS3的缺失會破壞E3連接酶復(fù)合物的形成，導(dǎo)致整合素β1蛋白表達累積。COIP、GST-pulldown結(jié)果表明，整合素β1是CUL5-SOCS3復(fù)合物的降解底物。

圖4 CUL5-SOCS3 E3泛素化鏈接酶復(fù)合物促進整合素β1泛素化、降解

蛋白質(zhì)的泛素連接由E3泛素連接酶催化，該酶是Cullin-RING復(fù)合體超級家族的最佳代表。Cullin-Ring Ligase（CRL）中CRL5依賴RNF7泛素化降解底物，RNF7缺失導(dǎo)致整合素β1累積，提示CUL5、SOCS3、RNF7是E3連接酶降解整合素β1的主要成分。

K48，K63，K11位多聚泛素化修飾是蛋白酶降解底物的經(jīng)典信號，研究報道CRL5 E3連接酶通過K11位多聚泛素化修飾來降解底物。我們的研究也表明CUL5-SOCS3連接酶復(fù)合物促進整合素β1的K11位多聚泛素化修飾。

為了進一步鑒定整合素β1胞質(zhì)尾區(qū)的特異性賴氨酸殘基與泛素化鏈的共價結(jié)合，我們通過精氨酸殘基取代賴氨酸殘基，獲得一系列的整合素β1突變體，并檢測這些突變體對CUL5-SOCS3復(fù)合物介導(dǎo)的泛素化和降解應(yīng)答。研究表明，整合素β1-K752R和K768R位點突變更有效抑制SOCS3介導(dǎo)的蛋白降解和較少的泛素化。

圖5 CUI5和SOCS3缺失通過影響整合素β1促進SCLC進程

CUL5突變（K137T,R167I,M262V,K286R）減弱了CUL5和SOCS3的相互作用，導(dǎo)致整合素β1表達量增高；在CUL5缺失細胞中過量表達CUL5，整合素β1表達量降低；與底物相互作用的SOCS3 SH2缺失一致，SOCS3 K28R突變體不能與整合素β1相互作用，促進其降解。在SCLC中，CUL5和 SOCS3突變會使CUL5-SOCS3E3復(fù)合物失活，并且不能促進底物降解。另外，臨床數(shù)據(jù)分析表明，腫瘤組織中CUL5/SOCS3低表達的小細胞肺癌患者往往伴隨整合素β1高表達，并且患者預(yù)后較差。

圖6 CUL5-SOCS3復(fù)合物通過整合素β1/FAK/SRC信號通路抑制SCLC和轉(zhuǎn)移

研究人員發(fā)現(xiàn)，CUL5/SOCS3缺失所導(dǎo)致的整合素β1累積主要通過激活其下游的FAK/SRC信號通路，最終促進了小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移。

圖7 達沙替尼治療對CUL5缺失小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響

有研究表明，SRC在惡性腫瘤中扮演重要作用?？紤]到SRC缺失可能有效抑制CUL5缺陷性SCLC轉(zhuǎn)移。利用臨床前動物模型進一步發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DA批準的SRC抑制劑達沙替尼灌胃SCLC模型小鼠，確實能有效地抑制CUL5缺失的小鼠SCLC惡性進展。

圖8 達沙替尼對CUL5缺失的SCLC模型的影響

接下來，我們檢測達沙替尼在人SCLC模型中的效果。在多個人SCLC細胞模型中分別敲除CUL5和SOCS3，體外研究表明，CUL5和SOCS3敲除對達沙替尼的敏感性沒有影響，但是顯著抑制了遷移。體內(nèi)移植瘤結(jié)果表明，達沙替尼通過抑制增殖，促進凋亡介導(dǎo)CUL5敲除異種移植腫瘤的生長。

總的來說，該研究揭示了CUL5/SOCS3復(fù)合物在小細胞肺癌轉(zhuǎn)移中的重要調(diào)控作用，并提示靶向SRC可作為治療CUL5缺失的小細胞肺癌的潛在策略。