分子機(jī)制已經(jīng)是發(fā)表完文章必不可少的一環(huán)實(shí)驗(yàn)，下面給大家詳細(xì)介紹一款，如何在蛋白層次挖掘機(jī)制？CO-IP（蛋白互作免疫共沉淀）。

CO-IP是用于檢測(cè)或探究蛋白與蛋白之間相互作用的實(shí)驗(yàn)，屬于IP實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)展，在樣品溶液中，捕獲和純化通過(guò)天然相互作用及靶標(biāo)結(jié)合的其他大分子蛋白，基于抗原抗體的特異性免疫結(jié)合，以餌蛋白為誘餌蛋白，通過(guò)餌蛋白抗體捕獲，磁珠吸附結(jié)合，進(jìn)而將餌蛋白結(jié)合的互作蛋白捕獲得到，純化定量定性分析。

具體操作步驟：

1、準(zhǔn)備樣本

樣品分為組織和細(xì)胞兩種，是最常見的，組織就用液氮研磨，研磨時(shí)候，少量多次加入液氮，記得研磨時(shí)用研磨杵按住組織旋轉(zhuǎn)研碎，戴個(gè)護(hù)目鏡或是頭盔，知道為什么？因?yàn)椴淮髯o(hù)目鏡可能會(huì)瞎，不戴頭盔，可能會(huì)毀容。細(xì)胞就簡(jiǎn)單了，直接消化下來(lái)離心，預(yù)冷1XPBS清洗1-2次，有人說(shuō)，消化會(huì)對(duì)細(xì)胞有影響，不入細(xì)胞刮子刮下來(lái)好，其實(shí)兩種想法都可以，消化是影響細(xì)胞膜表面蛋白構(gòu)象，尤其是層黏連蛋白和粘附蛋白改變，導(dǎo)致細(xì)胞貼壁不牢，進(jìn)而脫落，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白影響幾乎沒(méi)有，細(xì)胞刮子刮下來(lái)也行，雖然存在物理機(jī)械損傷，但損傷相對(duì)來(lái)說(shuō)，可忽略，兩種方法相較來(lái)說(shuō)，細(xì)胞刮操作，物理影響會(huì)小些。

2、細(xì)胞裂解

這步很關(guān)鍵，記住要使用弱裂解液，不要直接用WB裂解蛋白的裂解液，我們要做免疫共沉淀，要保留細(xì)胞內(nèi)天然構(gòu)建結(jié)合，強(qiáng)裂解液把蛋白都變性了，不能用強(qiáng)，要弱，弱性裂解液在于表面活性劑，比如NP-40、Triton X-100都不錯(cuò)。

3、磁珠清洗及抗體孵育

這步正常操作，磁珠用之前搖一搖，按照使用量吸取，不要用小槍頭，用1ml大槍頭，且是無(wú)菌無(wú)酶，加入適量抗體與buffer，混入磁珠即可，對(duì)了，磁珠人員黏連到移液槍頭，放入溶液中反復(fù)吹打幾次就好。

4、磁珠-抗體-裂解液孵育

核心步驟在這步，磁珠與抗體孵育完成后，請(qǐng)buffer清洗3次，再加裂解液，有人說(shuō)，為什么要清洗，還洗三次？這么問(wèn)的，最后都被老板罵了......為什么要清洗：去除未結(jié)合至磁珠表面的游離抗體，防止游離未結(jié)合的抗體結(jié)合到餌蛋白，降低結(jié)合總量。為什么洗三次？許多前輩和各種科研公司發(fā)現(xiàn)，清洗低于三次，殘留量比較大，清洗三次，殘留低于10%左右，清洗次數(shù)高于三次，結(jié)合至磁珠上的抗體，產(chǎn)生損失，綜合起來(lái)，三次最佳。磁珠-抗體復(fù)合物清洗完，加裂解液孵育，注意了，要顛轉(zhuǎn)孵育，不能靜置，磁珠是固體，溶液沉降，顛轉(zhuǎn)孵育，不但能使磁珠不沉降，而且使磁珠-抗體與蛋白結(jié)合更充分全面。放置4℃，顛轉(zhuǎn)過(guò)夜。

5、清洗純化磁珠-抗體-蛋白復(fù)合物

這步就關(guān)鍵了，這步要清洗6次，清洗少了，假陽(yáng)性，清洗次數(shù)多了，結(jié)合蛋白損失就大了，至于為什么要洗6次，前輩們做實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證出來(lái)的，發(fā)現(xiàn)6次是最佳的，清洗的時(shí)候，要用兩種buffer，一種低鹽，一種高鹽，盡量去除未結(jié)合的蛋白，防止假陽(yáng)性出現(xiàn)。

6、檢測(cè)

檢測(cè)就分為三種，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)。一種是銀染：按照input組、目的組、IgG組、beads組跑膠銀染，查看蛋白差異性；一種是WB檢測(cè)：根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)合的靶蛋白，進(jìn)行WB檢測(cè)，看有無(wú)條帶，確認(rèn)是否結(jié)合（要做內(nèi)參）；一種是MS（質(zhì)譜）檢測(cè)：質(zhì)譜檢測(cè)是根據(jù)產(chǎn)物蛋白，進(jìn)行酶解消化成多肽，再測(cè)定多肽，獲取序列，比對(duì)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，查看潛在結(jié)合蛋白有哪些，探討結(jié)合蛋白。

綜上完成，這個(gè)實(shí)驗(yàn)就結(jié)束了。最后通過(guò)案例分析，給大家提供一些文章思路。

文章思路

已有靶標(biāo)分子DDX17，通過(guò)生物性學(xué)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和免疫組化（IHC）驗(yàn)證在肝癌病理中是一個(gè)重要的靶標(biāo)蛋白，且是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；

細(xì)胞水平：肝癌細(xì)胞系SMMC7721、HEPG-2細(xì)胞中，通過(guò)過(guò)表達(dá)和敲低DDX17，探討細(xì)胞的表型變化，遷移和侵襲；

分子機(jī)制：蛋白水平調(diào)控，CO-IP連用GST-pull down，調(diào)取與之互補(bǔ)結(jié)合的靶蛋白KLF4；

深度機(jī)制挖掘：蛋白調(diào)控水平是通過(guò)結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域，破壞鋅指結(jié)構(gòu)域之后，不能引起結(jié)合和調(diào)控，與EMT（上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）相關(guān)基因失去調(diào)控作用。

詳細(xì)圖解：

TCGA+IHC驗(yàn)證靶標(biāo)分子DDX17是肝癌發(fā)生過(guò)程中重要分子

DDX17與肝癌的遷移和侵襲相關(guān)

CO-IP聯(lián)用GST-pull down技術(shù)，尋找與DDX17結(jié)合的互作蛋白KLF4

深度挖掘，獲取結(jié)合位點(diǎn)為鋅指結(jié)構(gòu)域