? ? ? ?對(duì)于流行性傳染疾病，特別是具有一定潛伏時(shí)期的病毒感染，對(duì)患病人員的確診非常重要。無(wú)論是2003年的非典還是我們現(xiàn)在正在遭受的新型冠狀病毒（2019-nCoV）疫情，如果在感染初期或者輕癥時(shí)期即可通過(guò)檢測(cè)手段進(jìn)行確診，治愈幾率及預(yù)后情況都會(huì)大大提高。

? ? ? ?CRISPR/Cas技術(shù)以出眾的基因編輯能力聞名于世，但顯然這技術(shù)應(yīng)用范圍絕不僅限于基因編輯。CRISPR/Cas技術(shù)的大牛Jennifer Doudna教授早在2016年就將該技術(shù)應(yīng)用于RNA檢測(cè)，只是由于靈敏度太低而缺乏應(yīng)用價(jià)值。隨后張鋒大牛利用Cas13蛋白的天然RNase活性將其改進(jìn)，使之有了實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并將其取名為SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing），并且開(kāi)發(fā)了升級(jí)版的SHERLOCK v2。后來(lái)Jennifer Doudna的實(shí)驗(yàn)室利用Cas12a的非特異性ssDNA降解能力開(kāi)發(fā)出另一種稱為DETECTR的方法。?

? ? ? ?01、SHERLOCK的原理

? ? ? ?SHERLOCK的核心是一種叫做Cas13的CRISPR相關(guān)蛋白。Cas13包含四個(gè)不同的家族成員（Cas13a-d），是一種RNA引導(dǎo)的RNase，靶向RNA的單鏈區(qū)域，在具有特定堿基的靶RNA區(qū)域產(chǎn)生多個(gè)切割位點(diǎn)。Cas13表現(xiàn)出靶依賴性的混雜RNA酶活性，導(dǎo)致旁觀RNA分子的反式切割，這種效應(yīng)被稱為“collateral activity （附帶活性）”。研究人員利用這一“脫靶缺陷”，加入一種可淬滅的熒光RNA，當(dāng)熒光RNA被切開(kāi)時(shí)，會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)而顯示檢測(cè)結(jié)果。 最近發(fā)現(xiàn)其它類型CRISPR-Cas系統(tǒng)的Cas酶也顯示collateral activity ，如Cas12的亞家族。 盡管Cas13具有稱為原間隔物側(cè)翼位點(diǎn)（PFS）的PAM樣序列基序，僅對(duì)某些目標(biāo)位點(diǎn)有活性，但是許多非?；钴S的Cas13直系同源物，例如LwaCas13a，不顯示PFS。?

? ? ? ?DETECTR技術(shù)的原理與SHERLOCK相似。Cas12a（Cpf1）通過(guò)crRNA靶向特定的雙鏈DNA，切割目標(biāo)雙鏈DNA后，會(huì)對(duì)所有的單鏈DNA發(fā)動(dòng)任意切割。將ssDNA-熒光淬滅（FQ）報(bào)道基團(tuán)加入反應(yīng)中，在ssDNA降解時(shí)就會(huì)產(chǎn)生熒信號(hào)。

? ? ? ?02、SHERLOCK的流程

? ? ? ?利用SHERLOCK系統(tǒng)檢測(cè)樣品的流程為：

? ? ? ?? 收集樣品，提取樣品的DNA或者RNA；

? ? ? ?? 以提取的DNA為模板在42℃下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，或者將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板在42℃下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

? ? ? ?? 以等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物為模板體外轉(zhuǎn)錄單鏈RNA；

? ? ? ?? 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與Cas13和檢測(cè)探針?lè)跤?，檢測(cè)熒光信號(hào)。

? ? ? ?制備SHERLOCK系統(tǒng)需要原核表達(dá)和純化Cas13，設(shè)計(jì)crRNA并且體外轉(zhuǎn)錄，制備帶熒光標(biāo)記的單鏈RNA探針。

? ? ? ?03、SHERLOCKv2

? ? ? ?與SHERLOCK比較，SHERLOCKv2具有有4個(gè)方面的改進(jìn)：?

? ? ? ?? 4通道單反應(yīng)多重分析，1個(gè)反應(yīng)可以檢測(cè)4種核酸，使用了1個(gè)Cas13a、兩個(gè)不同菌株的Cas13b和1個(gè)Cas12a ，每個(gè)酶的crRNA不同，激活后能切割的核苷酸序列也不相同；

? ? ? ?? 可以定量測(cè)量低至2 attomolar（ 10-18摩爾? ）的底物；

? ? ? ?? 通過(guò)將Cas13與Csm6（一種與CRISPR相關(guān)的輔助酶）結(jié)合，使信號(hào)靈敏度提高3.5倍；

? ? ? ?? 切割后的報(bào)告基團(tuán)可通過(guò)試紙條來(lái)檢測(cè)，不用依賴熒光。

? ? ? ? ?

? ? ? ?04、SHERLOCK的優(yōu)勢(shì)

? ? ? ?與常用的診斷技術(shù)ELISA（酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定）、熒光RT-PCR（實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）等比較，SHERLOCK的優(yōu)勢(shì)包括：

? ? ? ?? 檢測(cè)范圍廣，SHERLOCK使用的LwaCas13a沒(méi)有PAM，因此可以檢測(cè)任何核酸序列；

? ? ? ?? 靈敏度高，可以定量測(cè)量低至2 attomolar（ 10-18摩爾）的底物；

? ? ? ?? 使用方便，用試紙條檢測(cè)不需要特殊的設(shè)備；

? ? ? ?? 成本低，每次測(cè)試僅需要0.61美元（約為4.2元人民幣）。

? ? ? ?05、SHERLOCK的應(yīng)用

? ? ? ?SHERLOCK可以用于檢測(cè)寨卡病毒、登革熱病毒的特定株系，檢測(cè)大腸桿菌和綠膿桿菌的基因組，對(duì)人類DNA進(jìn)行基因分型，鑒定游離DNA中的低頻率癌癥突變（Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017, 356(6336):438-442）；檢測(cè)大豆的草甘膦抗性基因（Abudayyeh et al. Nucleic Acid Detection of Plant Genes Using CRISPR-Cas13. CRISPR J.? 2019, 2:165-171）?；蚓庉嫶笈堜h已利用SHERLOCK系統(tǒng)檢測(cè)冠狀病毒2019-nCoV。